腫瘤分泌的通透性因子與內皮細胞上的粘附蛋白之間的相互作用誘導的血管破壞促進轉移。由于缺少對cANGPTL4怎樣調節血管完整性的理解，腫瘤分泌的血管生成素樣4(cANGPTL4)在血管滲漏和轉移中的作用是有爭議的。這里，我們顯示cANGPTL4通過以時間順序的方式與3個新的結合配對物整聯蛋白α5β1、VE鈣粘著蛋白和密蛋白-5直接相互作用來促成內皮連續性的破壞，因此促進轉移。我們顯示cANGPTL4結合并激活整聯蛋白α5β1介導的Rac1/PAK信號傳導以減弱細胞-細胞接觸。隨后cANGPTL4與VE-鈣粘著蛋白和密蛋白-5相連并分離VE-鈣粘著蛋白和密蛋白-5，導致內皮破壞。干擾這些cANGPTL4復合物的形成延遲血管破壞。利用注射對照或ANGPTL4敲低腫瘤的ANGPTL4敲除和野生型小鼠進行的體內血管通透性和轉移測定證實cANGPTL4在小鼠中誘導血管滲漏并促進肺轉移。因此，我們的發現解釋了cANGPTL4怎樣誘導內皮破壞。我們的發現對靶向cANGPTL4以治療癌癥和其他血管病變具有直接意義。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】血管生成素樣4及其在調節細胞滲漏中的用途相關申請的交叉引用本申請要求于2011年8月8日提交的美國臨時專利申請第61/521,031號的權益和優先權，其內容援引加入本文。
本專利技術涉及細胞通透性的調節。
技術介紹
內皮細胞滲漏是在腫瘤血管中常觀察到的現象，并且參與哮喘、膿毒和心血管疾病的發病機理。通常，內皮細胞形成緊密的單層，其僅允許小分子如離子和溶質通過。在病理情況下，提高的內皮細胞通透性或細胞-細胞連接的破壞引起內皮滲漏，允許大分子或細胞(例如腫瘤細胞和巨噬細胞)更容易地通過血管。另一方面，滲漏的內皮細胞層有利于藥物遞送至靶組織。因此，根據上下文和目的，誘導或抑制血管滲漏可以是有利的。血管的內皮由緊密壓在一起的相鄰的內皮細胞組成。這些相鄰的細胞形成粘附結構，包括粘附和緊密連接，這是建立細胞極性、存活以及維持屏障功能所需的。分別控制分子在兩個細胞中間或跨越單個細胞移動的旁細胞和跨細胞通透性調節內皮屏障功能。但是在癌癥轉移中，由細胞間粘附和緊密連接控制的旁細胞通透性通常受損。血管生成素樣4(ANGPTL4)為脂肪細胞因子，并且還作為基質細胞蛋白發揮功能。ANGPTL4在多種腫瘤類型中預測較差預后的緊湊體內低氧特征中鑒定為突出的(prominent)基因。已發現ANGPTL4mRNA在許多人腫瘤的周圍壞死區域、透明細胞腎癌、口腔舌鱗狀細胞癌和人胃癌中上調表達。糖尿病性潰瘍的特征在于失活組織的積累、增加/延長的炎癥、不良的傷口相關的血管發生以及減少的基質沉積。研究以調查這些改變以更好地理解傷口愈合異常，以及特別針對糾正這些缺陷靶向治療。重組PDGF-BB(貝卡普勒明)是目前為止美國食品和藥物管理局批準的用于治療糖尿病足部潰瘍的唯一生長因子。已知PDGF-B是基質細胞的強效促細胞分裂劑和趨化劑，并且可以通過刺激血管發生來發揮作用以增加傷口血管形成。在糖尿病患者中需要可選治療或方法以加速傷口修復。腫瘤轉移是癌癥患者死亡的主要原因(1)。這主要是由血管滲漏以及內滲和外滲的關鍵步驟決定的，其包括腫瘤細胞定向遷移跨越被破壞的內皮。內皮提供血液與腫瘤之間的半透性邊界。內皮的旁細胞通透性主要由連接至肌動蛋白細胞骨架(2)并連接相鄰的內皮細胞(EC)(3)的跨膜內皮粘附連接(AJ)和緊密連接(TJ)蛋白介導。因此，AJ和TJ的主要組分如細胞間VE-鈣粘著蛋白和密蛋白-5團的破壞導致肌動蛋白細胞骨架、細胞形狀的改變以及細胞內信號傳導途徑的激活，這部分通過β-聯蛋白啟動基因轉錄(4)。除了AJ和TJ，整聯蛋白也增強EC-EC接觸并在細胞組織、增殖和遷移期間為細胞骨架重組提供支架(5)。具體地，整聯蛋白α5β1的表達調節內皮單層完整性(6)。本質上，轉移需要腫瘤細胞與EC之間的通訊，其以EC-EC接觸的破壞和血管基底膜的降解結束。但是，對促進這樣的通訊的分子機制仍缺乏了解。在腫瘤微環境中，腫瘤細胞之間的相互作用、它們分泌的因子和內皮誘導血管通透性以幫助腫瘤轉移(5,7)。這些因子結合至同源細胞受體，引起確定惡性結果的下游分子信號傳導事件的級聯(8,9)。血管生成素樣4(ANGPTL4)蛋白牽涉癌癥(10)，但是，其在癌癥生物學中的確切作用仍有爭議。ANGPTL4鑒定為在癌癥患者中最高度表達的基因之一(13)。盡管在癌癥中大量證據涉及ANGPTL4，ANGPTL4在疾病發展中的異型作用仍不清楚。本專利技術試圖改善上述問題中的至少一個。
技術實現思路
因此，本專利技術的第一方面包括一種通過控制細胞環境中血管生成素樣4(ANGPTL4)的濃度或活性來調節內皮細胞通透性的方法。本專利技術的另一方面包括一種治療患者以至少減少內皮細胞通透性的方法，所述方法包括使感染者與cANGPTL4拮抗劑接觸的步驟。本專利技術的另一方面包括一種方法，其包括利用佐劑和cANGPTL4制備抗體的步驟；以及向患有血管相關疾病的患者施用所述抗體。本專利技術的另一方面包括一種包含治療有效量的cANGPTL4濃度調節劑的組合物。本專利技術的另一方面包括所述組合物在制備用于治療患有血管相關疾病的患者的藥物中的用途。本專利技術的另一方面包括一種確定樣品中內皮細胞通透性程度的方法，所述方法包括以下步驟：測量所述樣品中ANGPTL4蛋白的量。從隨后參考以下優選實施方案的示圖進行的說明的綜述，本專利技術的其他方面和優點對于本領域技術人員會變得清楚。附圖說明圖1：cANGPTL4在轉移性腫瘤中升高并破壞內皮連接完整性。(A,B)如通過qPCR和免疫印跡確定的，分別在與腫瘤外周正常組織配對的基細胞癌(BCC)和轉移性黑色素瘤中cANGPTL4mRNA(A)和蛋白(B)的表達水平(n=3)。來自相同個體的數據點通過彩色線條連接。核糖體蛋白L27(L27)用作參考持家基因。β-微管蛋白用作上樣和轉移對照。(C,D)A-5RT3CTRL-、A-5RT3ΔANGPTL4-誘導的伊文思藍染料外滲誘導不同(C)或相似(D)腫瘤體積的腫瘤。(A-5RT3CTRL1098±422mm3v.sA-5RT3ΔANGPTL4551±135mm3,P<0.05,n=6)(E,F)cANGPTL4或PBS媒介物誘導的伊文思藍染料外滲(G)以及通過在610nm處測量吸光度定量外滲的伊文思藍染料(H)。*,P<0.05.(G)在A-5RT3CTRL-,A-5RT3ΔANGPTL4-誘導的腫瘤中免疫檢測CD31。(H)在B16F10CTRL-和B16F10ΔANGPTL4-誘導的腫瘤中CD31和cANGPTL4的免疫熒光染色。比例尺：100μm。(I)在匯合的HMVEC單層中ZO-1的免疫熒光染色。將細胞在抗cANGPTL4的存在或不存在下用來自A-5RT3CTRL的CM處理，或者用來自A-5RT3ΔANGPTL4細胞的CM處理。將HMVEC用DAPI(藍色)復染核并用鬼筆環肽(紅色)復染肌動蛋白應力纖維。比例尺：40μm。白色箭頭指示內皮連接損傷。(J)用所示量的cANGPTL4處理的匯合的單層HMVEC的跨內皮電阻(TER)分析。PBS用作媒介物對照。來自3個獨立實驗的數據(平均值±S.D.)。圖2：cANGPTL4與整聯蛋白α5β1、VE-鈣粘著蛋白和密蛋白-5相互作用。(A-E)顯示固定的cANGPTL4與整聯蛋白α5β1、VE-鈣粘著蛋白、密蛋白-5、閉合蛋白和連接粘附分子A(JAM-A)(A)；VE-鈣粘著蛋白胞外重復結構域1(EC1)、密蛋白-5第一胞外結構域(ECD1)、VE-鈣粘著蛋白EC3和密蛋白-5ECD2(B)；用免疫前IgG或所示同源抗體預封閉的整聯蛋白α5β1(C)、VE-鈣粘著蛋白(D)和密蛋白-5(E)之間的結合譜的代表性傳感圖。(F)cANGPTL4與所示結合配對物的原位鄰位連接測定(PLA)。PLA信號為紅色(對于250個細胞，整聯蛋白22.50±5.01對VE-鈣粘著蛋白16.43±2.46對密蛋白-512.35±3.44PLA點/細胞，n=3)。將細胞用Alexa488-鬼筆環肽復染肌動蛋白應力纖維(綠色)并用Hoechst染料復染核(藍色)。在抗ANGPTL4不存在下進行陰性對照。比例尺：40μm。(G)來自用cANGPTL4(3或6μg/ml)處理3h的HMVEC的膜提取物的V本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種通過控制細胞環境中血管生成素樣4(ANGPTL4)的濃度或活性來調節內皮細胞通透性的方法。
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2011.08.08 US 61/521,0311.一種通過去除、降解或中和細胞環境中血管生成素樣4的c端區域(cANGPTL4)的濃度或活性來最小化、減少或抑制內皮細胞通透性的體外方法，其中所述cANGPTL4被cANGPTL4特異性抗體去除、降解或中和，所述cANGPTL4特異性抗體能夠結合選自人ANGPTL4蛋白中的186–406區域的氨基酸序列或者選自小鼠ANGPTL4蛋白中的190-410區域的氨基酸序列。2.權利要求1的體外方法，其中所述抗體是催化性的。3.血管生成素樣4的c端區域(cANGPTL4)的抗體在制備治療患者以減少內皮細胞通透性的藥物中的用途，其中所述抗體能夠結合選自人ANGPTL4蛋白中的186–406區域的氨基酸序列或者選自小鼠ANGPTL4蛋白中的190-410區域的氨基酸序列。4.權利要求3的用途，其中所述抗體為cANGPTL4的中和抗體。5.權利要求3或4的用途，其中所述抗體干擾提高的內皮細胞通透性。6.佐劑和血管生成素樣4的c端區域(cANGPTL4)多肽在制備用于最小化、減少或抑制內皮細胞通透性的抗體中的用途，其中所述抗體能夠向患有血管相關疾病的患者施用，并且其中所述抗體能結合選自人ANGPTL4蛋白中的186–406區域的氨基酸序列或者選自小鼠ANGPTL4蛋白中的190-410區域的氨基酸序列。7.權利要求6的用途，其中所述血管相關疾病選自炎癥性水腫、糖尿病和動脈粥樣硬化。8.權利要求6的用途，其中所述血管相關疾病為癌癥轉移。9.權利要求8的用途，其還包括向所述患者施用抗癌劑。10.治療有效量的血管生成素樣4的c端區域(cANGPTL4)的抗體在制備用于最小化、減少或抑制內皮細胞通透性...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳源順，
申請(專利權)人：南洋理工大學，
類型：發明
國別省市：新加坡;SG
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。