本發明專利技術屬于食用菌分子標記輔助育種領域，更具體涉及一種雙孢蘑菇菌株子實體顏色SCAR-PCR鑒定方法。該方法利用SCAR分子標記對雙孢蘑菇棕色菌株進行PCR特異擴增，從而鑒定菌株的子實體顏色。本發明專利技術的方法用于不用出菇試驗，特異性地鑒別雙孢蘑菇菌株子實體顏色，該方法耗時短，操作簡便，特異性強，只針對雙孢蘑菇棕色菌株特異性擴增出1273bp的產物，可以在雙孢蘑菇雜交育種中快速地鑒定菌株的子實體顏色，極大的提高了雙孢蘑菇雜交育種的效率。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于食用菌分子標記輔助育種領域，更具體涉及一種雙孢蘑菇菌株子實體顏色SCAR-PCR鑒定方法。
技術介紹
雙孢蘑菇（Agaricus?bisporus）是世界上人工栽培最廣泛、產量最高、消費量最大的食用菌，具有重要的經濟價值。目前，我國的雙孢蘑菇主栽品種單一，當家品種As2796從育種至今已使用二十年，面臨著商業菌株不可避免的退化問題。另一方面，由于產業持續健康發展的需要及生產和市場的日漸多樣化需求亟須選育一些適合不同用途的專用優良新菌株。近年來，福建省農業科學院食用菌研究所（本專利技術人單位）收集了具有我國自主知識產權的野生雙孢蘑菇種質資源，如何快速評價和利用這些野生種質成為新品種選育的關鍵。野生種質中很大一部分菌株為棕色，在利用野生種質進行雜交選育的過程中如何根據市場需求對雜交后代進行顏色性狀的篩選是育種工作面臨的一個重要問題。傳統的篩選手段盲目性強，需要進行出菇來篩選，工作量巨大，急需開展顏色性狀定向遺傳篩選的研究。近年來發展的DNA分子標記輔助育種技術是食用菌定向輔助育種的一個重要方向。SCAR（Sequence?Characterized?Amplified?Regions，特征序列擴增區域）標記由于檢測方便、快速、可靠，可快速檢測大量個體等眾多優點已成為目前分子標記在育種實踐中能直接應用的首選標記。2011年我所承擔了福建省科技廳公益類科研院所專項“雙孢蘑菇SCAR標記的發掘及其輔助育種平臺的建立”，項目組在原有基礎上經多次實驗，取得了一個與雙孢蘑菇菌株子實體顏色緊密連鎖的分子標記，利用該分子標記能在雙孢蘑菇雜交育種中快速的鑒定菌株的子實體顏色，不用出菇試驗，省時省力，這對雜交育種中縮短育種周期、提高育種效率及定向篩選有著重要的意義。?
技術實現思路
本專利技術基于分子標記技術，建立一種雙孢蘑菇菌株子實體顏色SCAR-PCR鑒定方法。本專利技術的一種雙孢蘑菇菌株子實體顏色SCAR-PCR鑒定方法，是利用SCAR分子標記對雙孢蘑菇菌株進行PCR特異擴增，從而鑒定菌株的子實體顏色。本專利技術利用特異引物對雙孢蘑菇菌株的基因組DNA進行SCAR-PCR擴增，所述特異引物的核苷酸序列為：SCAR4-F：5’-CAAGTACTGAAAGTGTACTA-3’，?SCAR4-R：5’-GAGCCTTTCCATGTGCTCAC-3’。利用所述特異引物對雙孢蘑菇菌株的基因組DNA進行SCAR-PCR擴增，特異性地擴增出1273bp的產物，其中菌株子實體顏色為棕色的擴增為陽性，菌株子實體顏色為白色的擴增為陰性。所述SCAR-PCR擴增的條件為：?94℃預變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，擴增35個循環；72℃延伸10min，?4℃保存。所述SCAR-PCR擴增的反應體系為：?模板DNA?30ng，上游引物30ng，下游引物30ng，dNTPs?0.1?mmol/L，MgCl2?2.5?mmol/L，Taq?DNA聚合酶?1?U，1×PCR緩沖液10μL，用ddH2O將總體積補至20μL。本專利技術的方法用于特異性地鑒別雙孢蘑菇菌株子實體顏色，該方法耗時短，操作簡便，特異性強，無需出菇，省時省力。根據特異性擴增產物1273bp條帶的有無來鑒定菌株的子實體顏色，擴增產物呈陽性的菌株子實體顏色為棕色，擴增產物呈陰性的菌株子實體顏色為白色。附圖說明圖1為44個雙孢蘑菇菌株的SCAR-PCR擴增產物圖譜。具體實施方式：實施例1：1、Taq?DNA聚合酶、PCR緩沖液、MgCl2?、dNTPs購自廈門泰京生物有限公司，DNA序列上海生工有限公司測序，引物委托上海生工有限公司合成，引物的核苷酸序列為：SCAR4-F：5’-CAAGTACTGAAAGTGTACTA-3’，?SCAR4-R：5’-GAGCCTTTCCATGTGCTCAC-3’。2、44個雙孢蘑菇菌株來源于福建省農業科學院食用菌研究所遺傳育種研究室，其菌株編號和菌株名稱參見（附錄：表一）3、雙孢蘑菇DNA提取與電泳雙孢蘑菇DNA提取與DNA電泳按照文獻[陳美元，廖劍華，李洪榮，郭仲杰，盧政輝，蔡丹鳳，王澤生.?雙孢蘑菇栽培菌株遺傳多樣性的DNA指紋分析[J].?中國農學通報，2009，(04)：149-156.]。4、SCAR-PCR反應體系與條件反應體系為：?模板DNA?30ng，上游引物30ng，下游引物30ng，dNTPs?0.1?mmol/L，MgCl2?2.5?mmol/L，Taq?DNA聚合酶?1?U，1×PCR緩沖液10μL，用ddH2O將總體積補至20μL。擴增條件為：?94℃預變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，擴增35個循環；72℃延伸10min，?4℃保存。PCR產物電泳按照文獻[陳美元，廖劍華，王波，李洪榮，盧政輝，郭仲杰，蔡丹鳳，王澤生.?中國野生蘑菇屬90個菌株遺傳多樣性的DNA指紋分析[J].?食用菌學報，2009，(01)：11-16.]。5、結果分析SCAR-PCR檢測結果如圖1，1-22號為雙孢蘑菇棕色菌株，檢出特異性SCAR-PCR產物(1273bp)，檢出陽性率100%。23-44號為雙孢蘑菇白色菌株，均未檢出PCR產物，檢出陽性率為0%。可見，該標記與雙孢蘑菇菌株子實體棕色性狀緊密連鎖。該方法可以對雙孢蘑菇菌株的子實體顏色進行有力地區分和鑒定。附錄：1、表1：圖1中的44個菌株編號及菌株名稱注：其中B表示Brown，子實體棕色。W表示White，子實體白色。?序列表?<110>??福建省農業科學院食用菌研究所?<120>??一種雙孢蘑菇菌株子實體顏色SCAR-PCR鑒定方法?<160>??2?????<170>??PatentIn?version?3.3?<210>??1<211>??20<212>??DNA<213>??人工序列?<400>??1caagtactga?aagtgtacta?????????????????????????????????????????????????20??<210>??2<211>??20<212>??DNA<213>??人工序列?<400>??2gagcctttcc?atgtgctcac?????????????????????????????????????????????????20??本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種雙孢蘑菇菌株子實體顏色SCAR?PCR鑒定方法，其特征在于：利用SCAR分子標記對雙孢蘑菇菌株進行PCR特異擴增，從而鑒定菌株的子實體顏色。
【技術特征摘要】
1.一種雙孢蘑菇菌株子實體顏色SCAR-PCR鑒定方法，其特征在于：利用SCAR分子標記對雙孢蘑菇菌株進行PCR特異擴增，從而鑒定菌株的子實體顏色。
2.根據權利要求1所述的雙孢蘑菇菌株子實體顏色SCAR-PCR鑒定方法，其特征在于：利用特異引物對雙孢蘑菇菌株的基因組DNA進行SCAR-PCR擴增，所述特異引物的核苷酸序列為：
SCAR4-F：5’-CAAGTACTGAAAGTGTACTA-3’，?
SCAR4-R：5’-GAGCCTTTCCATGTGCTCAC-3’。
3.根據權利要求2所述的雙孢蘑菇菌株子實體顏色SCAR-PCR鑒定方法，其特征在于：利用所述特異引物對雙孢蘑菇菌株的基因組DNA進行SCAR-PCR擴增，特異性地擴增出1273bp的產物，...
【專利技術屬性】
技術研發人員：蔡志欣，陳美元，廖劍華，李洪榮，郭仲杰，蔡丹鳳，王澤生，
申請(專利權)人：福建省農業科學院食用菌研究所，
類型：發明
國別省市：福建;35
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