本發明專利技術涉及一株內生真菌及其生物轉化甘草酸為甘草次苷的方法，該菌命名為DX-SES3，鑒定為Microsphaeropsisarundinis，并已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCM2014177。該菌能在甘草酸的誘導下產生β-葡萄糖醛酸苷酶，進而催化甘草酸生產GAMG；所產生的GAMG富聚在菌體的表面，75%的乙醇沖洗菌體，減壓濃縮噴霧干燥后獲得GAMG粗制品，HPLC檢測純度為89.4%。本發明專利技術采用生物轉化方法，不僅甘草酸的轉化率高，綠色環保無污染，而且GAMG富聚于菌體表面，產物分離純化簡單易行。
【技術實現步驟摘要】
????本專利技術涉及生物轉化
及產物分離工藝，主要涉及一株能將甘草酸單一、定向的轉化為甘草次苷（GAMG）的東鄉野生稻內生真菌及GAMG分離純化制備方法。 技術背景 ???甘草酸（GL）是甘草中的主要活性成分之一，是甘草中含量最高的三萜類化合物，結構如圖1所示，是由五環三萜皂苷通過糖苷鍵連接兩個葡萄糖醛酸構成的。現代藥理學研究表明，甘草酸具有抗炎癥、抗病毒、抗過敏、抗腫瘤等藥理作用，還是一種高甜度、低熱量的新型甜味劑，具有一定的應用價值。 ????甘草酸經β-葡萄糖醛酸苷酶水解去除其末端的一個葡萄糖醛酸基就生成GAMG（如圖1），是甘草酸的一個重要的衍生物。甘草次苷又叫單葡萄糖醛酸基甘草次酸（GAMG），其應用價值遠大于甘草酸。首先，在食品中應用方面，GAMC的甜度約為蔗糖甜度的941倍，是甘草酸甜度的5倍多，GAMG不僅有較強的持續性甜味，是一種高甜度、低熱量的新型甜味劑，而且可有效減少因高熱量甜味劑的攝入引發的肥胖、糖尿病、高血脂癥、齲齒等疾病；其次，在藥物方面的應用，GAMG和甘草酸具有相類似的藥理作用，但甘草次苷中等極性，在體內溶解度較好的和較易跨膜轉運，比甘草酸生物利用度更好，其生物利用度優于甘草酸類藥物及甘草次酸類藥物，具有顯著的新藥物開發價值，如在對TPA誘導的Epstein-Barr病毒早期抗原形成的抑制率顯示，GAMG的抑制率達到了100%，而甘草酸的抑制率只有84.4%，許多研究表明了抗腫瘤、抗病毒、抗炎癥等方面有良好的功效，并證實其多種的藥理活性不亞于甘草酸，最重要的一點是甘草次苷比甘草酸更安全，甘草次苷的LD50為5000?mg/kg，而甘草酸的LD50?為805?mg/kg；最后，GAMG在化妝品中也有重要的應用，GAMG可使油性香水或荷爾蒙增溶，可用于透明化妝品中，不會產生泡沫，也可用于面霜或乳液中，配制成穩定的水包油乳液等。因此生產和開發GAMG具有很重要的應用價值和現實意義。 GAMG的獲取途徑比較少，主要途徑有以下幾條：一是化學合成法合成GAMG，Brieskorn等和Mizutani等首次合成了GAMG，但合成路線長，收率很低。二是傳統的化學水解法，通過水解去掉甘草酸的葡萄糖醛酸基生成甘草次苷，但此法對甘草酸的兩個糖苷鍵選擇性低，不能定向水解生成甘草次苷，副產物多，得率較低，同時存在高耗能，高污染的缺點。三是利用微生物所產生的β-D-葡萄糖醛酸酶水解甘草酸而制備得到的，這也是目前GAMG的主要獲得途徑，而其β-D-葡萄糖醛酸酶用量過大，來源不方便也不經濟，并且產物較難分離純化。此外，根據歐盟和美國的立法，通過化學方法獲得的產品不是天然物質，應用于食品領域受到限制，而利用酶法或微生物法（即生物轉化法）得到的物質，被認為是天然物質。生物轉化是指利用微生物、動植物和培養體系或其產生的酶對外源化合物進行結構修飾的生物化學反應過程，其本質是利用生物體系產生的酶對外源化合物進行酶催化反應。利用生物轉化甘草酸生成GAMG已有報道過，其不僅具有專一性高、效率高的優點，而且方法簡單、便于分離，是今后獲得GAMG的理想途徑。 本專利技術人從國家二級保護植物禾本科植物東鄉野生稻健康的組織中分離并篩選到能將甘草酸單一定向的轉化為GAMG的內生真菌——菌株DX-SES3?(Microsphaeropsi?sarundinis)。該菌已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC?M?2014177。該菌能在甘草酸的誘導下，能將甘草酸定向轉化為GAMG，且轉化率較高，特別指出的是，合成的GAMG富積在菌球的表面，極大的利于后續GAMG的分離純化工作，這為利用該菌株生物轉化生成制備GAMG提供了新的研究思路。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一株具有定向轉化甘草酸為GAMG的東鄉野生稻內生真菌DX-SES3?(Microsphaeropsi?sarundinis)。本專利技術不僅克服了現有工藝技術中催化定向性差，污染環境，高耗能，轉化率低等不足的缺點，而且還避免了GAMG分離純化的復雜工序。 本專利技術中轉化甘草酸為GAMG的內生真菌菌株，命名為DX-SES3，分類為小球殼孢屬菌Microsphaeropsi?sarundinis，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏時間為2014年5月3日，保藏號為CCTCC?M?2014177。 本專利技術所述的東鄉內生真菌菌株DX-SES3的形態特征為：在PDA上28℃培養5-7?d，5天菌落直徑為20?mm，7天菌落直徑為30-35?mm，7天菌落直徑無變化；質地絮狀，中部突起，表面灰白色，中間色深，邊緣色淺，老后顏色加深，無滲透液，無可溶性色素，菌落反面為黑色；菌絲細長彎曲，呈黑色或灰黑色；分身孢子較少，為蛹蟲狀（如圖2）。 本專利技術所述的東鄉野生稻內生真菌DX-SES3?(Microsphaeropsi?sarundinis)?基因登錄號為KC871028。 本專利技術所述的東鄉野生稻內生真菌DX-SES3?(Microsphaeropsi?sarundinis)轉化甘草酸定向生成甘草次苷包括以下步驟： 步驟一、將東鄉野生稻內生真菌DX-SES3?(Microsphaeropsi?sarundinis)，接種到PDA斜面培養基中培養活化72～84小時，并制作孢子懸浮液，然后接種至種子培養基中，28±1℃，150～300?r/min，搖床培養至對數生長期。 步驟二、按照質量分數10%～30％的接種量把上述對數生長期的種子液接種至含甘草酸的轉化培養基中，轉化產生甘草次苷至含量基本恒定。 步驟三、沖洗菌球表面的GAMG，并分離純化GAMG。 優選的是，所述的DX-SES3?(Microsphaeropsi?sarundinis)轉化甘草酸定向生成GAMG，步驟一中種子培養基的組成為：每升培養基中含葡萄糖10～40g，甘草酸（或甘草酸銨鹽）0.1～1?g，KH2PO41.0～3.0?g，?NH4NO3?2.0～5.0?g，?NaCl?0.3～0.8?g，酵母粉0.05～0.3?g，?MgSO40.1～0.5?g，?CaCl20.01～0.5?g，?FeSO4?0.014?g?，ZnSO4·7H2O?2.9?mg，MnCl2·4H2O?2.0?mg，?CuSO4·5H2O?0.25?mg，CoCl2·6H2O?0.24?mg，Na2MoO4·2H2O?0.24?mg，?H3BO3?0.03?mg，?其余為純水，調pH為5.0～7.0。 優選的是，所述的DX-SES3?(Microsphaeropsi?sarundinis)轉化甘草酸定向生成GAMG，在步驟二中轉化培養基組成為：每升培養基中含甘草酸（或甘草酸銨鹽）?2～30?g，?KH2PO4?1.0～3.0?g，?NH4NO3?2.0～4.0?g，?NaCl?0.3～0.8?g，酵母粉0.05～本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一株轉化甘草酸為GAMG的內生真菌菌株，其特征在于：命名為DX?SES3，分類為小球殼孢屬菌Microsphaeropsi?sarundinis，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏時間為2014年5月3日，保藏號為CCTCC?M?2014177。
【技術特征摘要】
1.一株轉化甘草酸為GAMG的內生真菌菌株，其特征在于：命名為DX-SES3，分類為小球殼孢屬菌Microsphaeropsi?sarundinis，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏時間為2014年5月3日，保藏號為CCTCC?M?2014177。
2.一種內生真菌生物轉化甘草酸為GAMG的方法，包括如下步驟：
1）內生真菌的活化及種子液的制備；
2）GAMG生物轉化：將步驟1）的種子液按質量分數20-40%的接種量加入到轉化培養基中，進行GAMG的生物轉化；
3）GAMG的分離制備：生物轉化后的GAMG富聚于內生真菌菌球的表面，布氏漏斗抽濾或六層紗布過濾，收集菌體，用體積比為20%～100%的乙醇溶液沖洗菌體3-5次，收集乙醇溶液，后減壓濃縮，再噴霧干燥，獲得純度較大的GAMG成品，并用HPLC、LC-MS進行檢測。
3.如權利要求2所述的內生真菌生物轉化甘草酸為GAMG的方法，其特征在于所述的內生真菌DX-SES3（Microsphaeropsis?arundinis）在PDA培養基中，28±1℃培養7?d，菌落的直徑為28～30?mm質地絨狀，中部凸起，同心輪紋狀，菌落灰色，邊緣色淺，無滲出液；菌落反面中央為黑褐色，其外圍為棕褐色，再外圍為淡黃色，培養時間菌落顏色變深為深灰色至褐色，但菌落不不變大；在CA培養基中，28±1℃培養6?d菌落直徑為37～39?mm，菌落起初白色后逐漸變成灰白色且，中央凸起且現絮狀，同心輪紋狀，邊緣整齊，背面白色，在光學顯微鏡下，菌絲有隔，可見蛹蟲狀的孢子囊結構。
4.如權利要求2所述的內生真菌生物轉化甘草酸為GAMG的方法，其特征在于所述的內生真菌DX-SES3（Microsphaeropsis?arundinis）菌株基因登錄號為KC871028。
5.如權利要求2所述的內生真菌生物轉化甘草酸為GAMG的方法，其特征在于所述的種子液培養制備為：將內生真菌DX-SES3（Microsphaeropsis?arundinis...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張志斌，高波良，朱篤，李平，顏日明，汪涯，
申請(專利權)人：江西師范大學，
類型：發明
國別省市：江西;36
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