半衰期延長的人因子IX變體制造技術

說明了糖基化位點數目增加的因子IX變體。所述因子IX變體的半衰期延長和/或回收提高。

【技術實現步驟摘要】
半衰期延長的人因子IX變體本申請是2008年10月15日提交的題為“半衰期延長的人因子IX變體”的國家申請號為200880122214.9 (PCT/US2008/011754)的專利技術專利申請的分案申請。優先權聲明根據35U.S.C.§ 119(e)，本專利申請要求2007年10月15日提交的美國臨時專利申請N0.60/999035的權益，該申請的全部內容以其全部形式作為參考并入本文。
本專利技術涉及包含附加的糖基化位點的因子IX變體，以及編碼該因子IX變體的核酸構建體。
技術介紹
_5] 相關技術的說明可商購的因子IX有血漿來源的產品(Mononine? )和重組蛋白(Benefix?)。Mononine?的缺點在于傳播通過由純化步驟所帶有的細菌和病毒(例如HIV,肝炎病毒)污染而造成的疾病的可能。重組蛋白(例如Benefix? )的使用避免了這些問題。然而，在實驗動物模型系統和人的靜脈內(1.v.)彈丸注入后，重組因子IX(r因子IX，例如Benefix? )的藥物動力學性質比人血漿來源的因子IX(Pd因子IX，例如Mononine?) 的性質差。由于r因子IX不夠良好的藥物動力學性質，因此一般r因子IX的劑量需要高20-30%以達到與pd因子IX相同的促凝血活性水平(White等，(Apri11998), Seminars inHematology, vol.35, n0.2Suppl.2:33-38 ；Roth 等,(Decemberl5, 2001) Blood vol.98 (13):3600-3606)。已證實向蛋白中添加糖基化位點是延長它們半衰期的重要工具。例如，達貝泊汀-a (Darbepoetin-α )是紅細胞生成素的重組形式，其中添加了兩個附加的N-連接糖基化位點(Elliott 等，Enhancement of therapeutic protein in vivo activitiesthrough glycoengineering, Nat Biotechnol.(2003)21:414-421)。為了產生達貝泊汀，將殘基30和32突變產生一個糖基化位點，并且將殘基87、88和90突變產生第二糖基化位點。具有這兩個附加糖基化位點的達貝泊汀的半衰期是正常紅細胞生成素的三倍；此外，它的安全性與紅細胞生成素沒有差別。盡管達貝泊汀分子具有5個氨基酸的變化，但是自2004年以來,未鑒別出對達貝泊汀的抗體發展的病例(Smalling等,“Drug-1nducedand antibody-mediated pure red cell aplasia:a review of literature and currentknowledge”，Biotechnol Annu Rev.(2004) 10:237-250 ；Sinclair 等，“Glycoengineering:the effect of glycosylation on the properties of therapeutic protein，，，J Pharm Sc1.(2005)94:1626-1635) o添加neo-糖基化位點也延長了痩素(Ieptin)和MpI配體的半衰期。本專利技術涉及生產具有附加的糖基化位點的因子IX(FIX)變體。該重組因子IX變體的回收值更高和/或半衰期更長從而使得可以向對象施用較低劑量和/或較低頻次的因子IX。專利技術簡述本專利技術提供了與野生型因子IX相比，包含一個或多于一個附加的糖基化位點的分離的因子IX(FIX)變體。可以通過以下方式的任意組合來引入所述一個或多個附加的糖基化位點:附加的氨基酸的插入、氨基酸的缺失、氨基酸的取代和/或氨基酸的重排。也可以通過定點突變和/或FIX變體的化學合成引入所述一個或多個附加的糖基化位點。在一些實施方式中，該附加的糖基化位點中的至少一個位于激活肽(activationpeptide)之內。該FIX變體可以包含插入至SEQ IDNO:33所示的人FIX氨基酸序列的N157和N167位置之間的肽片段，并且所述肽片段可以包含約3至約100個氨基酸殘基。所述肽片段可以包含小鼠因子IX激活肽的至少一部分(例如，圖1，第4行)并且可以修飾所述小鼠激活肽以增加糖基化位點數目(例如圖1，第2和3行)。本專利技術所述的FIX蛋白變體可以是人FIX蛋白。本專利技術所述變體FIX的一個或多個附加的糖基化位點可以是N-連接糖基化位點、O-連接糖基化位點以及N-連接糖基化位點和O-連接糖基化位點的組合。在一些實施方式中，糖基化位點可以包括N-連接糖基化位點，所述N-連接糖基化位點包含共有序列NXT / S，條件是X不是脯氨酸。在其他實施方式中，該糖基化位點包括O-連接糖基化位點，所述O-連接糖基化位點包含選自以下的共有序列:CXXGGT / S-C (SEQID NO:9)、NSTE / DA (SEQ ID NO:10)、NITQS (SEQ ID NO:11)、QSTQS (SEQ ID NO:12)、D/E-FT^R/K-V (SEQ ID NO:13)、C-E / D-SN (SEQ ID NO:14)、GGSC-K / R (SEQ ID NO:15)以及它們的任意組合。此外,本專利技術所述的FIX變體可以包含約I至約5個附加的糖基化位點。本專利技術還提供了包含編碼本專利技術所述FIX變體的核苷酸序列的載體，包含本專利技術所述載體的轉化的細胞以及包含本專利技術所述FIX變體的轉基因動物。在一些實施方式中，本專利技術所述FIX變體的至少一個附加的糖基化位點可以位于激活肽之外。此外，本專利技術所述FIX變體的至少一個附加的糖基化位點可以對應于在FIX的非人同源物的天然形式中被糖基化的位點，其中非人同源物可以是，例如，狗、豬、牛或小鼠。本專利技術還提供了增加因子IX蛋白中糖基化位點數目的方法，包括:a)將第一 FIX氨基酸序列與第二 FIX氨基酸序列比對；b)鑒別存在于所述第一 FIX氨基酸序列而不存在于所述第二氨基酸序列中的糖基化位點；c)修飾所述第二 FIX氨基酸序列以引入糖基化位點，該糖基化位點對應于步驟(b)中在第一 FIX氨基酸序列中鑒別出的糖基化位點，其中修飾所述第二 FIX氨基酸序列增加了 FIX蛋白中的糖基化位點數目。在本專利技術的方法中，第一 FIX氨基酸序列可以來自非人類物種，而第二氨基酸序列可以是人FIX。在這些方法的進一步實施方式中，第一FIX氨基酸序列中的糖基化位點可以位于激活肽之內或激活肽之外。這些方法還包括在所述激活肽之內和所述激活肽之外均添加一個或多個糖基化位點。 本專利技術還提供分離的FIX變體，與野生型FIX相比，該變體包含一個或多個附加的糖鏈。在一些實施方式中，通過化學和/或酶方法將所述一個或多個附加的糖鏈添加到FIX蛋白上。通過以下附圖，本專利技術的其他方面、特征和優勢將變得顯而易見。【附圖說明】現在將參考下列附圖對本專利技術的這些和其他特征進行說明，這些附圖旨在說明而并非限制本專利技術。圖1顯示了人因子IX變體。第I行:人因子IX (SEQ IDNO:5);第2行:具有小鼠激活肽(AP)片段的人因子IX，其中未修飾小鼠AP片段(SEQ ID NO:2);第3行:具有添加了一個本文檔來自技高網...

【技術保護點】
分離的因子IX(FIX)蛋白變體，其與野生型因子IX相比包含一個或多于一個附加的糖基化位點。

【技術特征摘要】
2007.10.15 US 60/999,0351.分離的因子IX(FIX)蛋白變體，其與野生型因子IX相比包含一個或多于一個附加的糖基化位點。2.根據權利要求1所述的FIX變體，其中所述一個或多于一個附加的糖基化位點中至少有一個位于激活肽中。3.根據權利要求1所述的FIX變體，其包含插入至SEQID NO:33所示的人FIX氨基酸序列的N157和N167位置間的肽片段。4.根據權利要求3所述的FIX變體，其中所述肽片段包含3-100個氨基酸殘基。5.根據權利要求4所述的FIX變體，其中所述肽片段包含小鼠因子IX激活肽的至少一部分。6.根據權利要求5所述的FIX變體，其中修飾了所述小鼠激活肽以增加糖基化位點數目。7.根據權利要求1所述的FIX變體，其中所述一個或多于一個附加的糖基化位點選自N-連接糖基化位點、O-連接糖基化位點以及N-連接糖基化位點和O-連接糖基化位點的組合。8.根據權利要求7所述的FIX變體，其中所述糖基化位點包含N-連接糖基化位點，所述N-連接糖基化位點包含共有序列NXT / S，條件是X不為脯氨酸。9.根據權利要求7所述的FIX變體，其中所述糖基化位點包含O-連接糖基化位點，所述O-連接糖基化位點包含選自以下的共有序列:CXXGGT / S-C (SEQ ID NO:9)、NSJE /DA(SEQ ID NO:10),NITQS(SEQ ID NO:11),QSTQS(SEQ ID NO:12)、D / E-FTzR / K-V(SEQ IDNO:13)、C-E / D-SN(SEQ ID NO:14)、GGSC-K / R(SEQ ID NO:15)和它們的任意組合。10.根據權利要求1-9中任一項所述的FIX變體，其包含1-5個附加的糖基化位點。11.載體，其包含編碼根據權利要求1-10中任一項所述的FIX變體的核苷酸序列。12.轉化的細胞，其包含根據權利要求11所述的載體。13.轉基...

【專利技術屬性】
技術研發人員：DW斯坦福德，DM曼，D馮，
申請(專利權)人：北卡羅來納查佩爾山大學，肯杰尼公司，
類型：發明
國別省市：美國;US