一種結核桿菌LAM寡糖綴合物及其制備方法與應用技術

本發(fā)明專利技術涉及一種結核桿菌LAM寡糖綴合物及其制備方法與應用。結核桿菌LAM寡糖綴合物，結構通式如下：本發(fā)明專利技術還涉及上述結核桿菌LAM寡糖綴合物在制備肺結核疫苗中的應用。本發(fā)明專利技術所述的結核桿菌LAM寡糖綴合物中，寡糖的化學結構是明確且單一的，而非混合物，可通過化學方法合成，它能夠解決卡介苗免疫保護力低的問題，對某些免疫力低下的人群同樣會產生較好的免疫效果，同時能夠避免抗生素的大量使用而帶來的細菌耐藥性的問題。

【技術實現步驟摘要】
一種結核桿菌LAM寡糖綴合物及其制備方法與應用
本專利技術涉及一種結核桿菌LAM寡糖綴合物及其制備方法與應用，屬于肺結核疫苗研制

技術介紹
肺結核是由結核分枝桿菌引起的傳染性疾病，具有較高的致死率。結核病主要通過呼吸道傳染，也可以通過消化道、皮膚和子宮傳染。大部分感染者通常沒有任何癥狀，只有部分機體免疫力較低或細胞介導的變態(tài)反應增高的感染者才會發(fā)病，如果不及時治療，大約有一半的感染者會死亡。近幾年這一疾病的發(fā)病率逐年上升。造成這一現象的原因主要有：(1)抗生素的濫用導致病菌耐藥性的不斷增強；(2)與艾滋病的交叉感染；(3)不發(fā)達國家較差的基礎醫(yī)療設施和環(huán)境(J.Infect.Dis.,1999,179,S461；Drugs,1997,53:40；Pharmacotherapy,1998,18:738)。因此，研制新型、有效、安全的結核病藥物成為國內外學者共同關注的一個重要課題。結核病的治療方法主要是抗生素和免疫治療。抗生素治療周期較長，不但給患者的免疫系統造成了非常大的傷害，而且使病菌的耐藥性不斷增強。免疫治療是預防結核病的非常有效的措施，不存在細菌耐藥性和削弱患者免疫力的問題。目前，預防結核病的主要疫苗是卡介苗(BCG)。但是，研究發(fā)現BCG對結核病的免疫保護力低于80％(TrendsMicrobiol.,2008,16:456)，對于有免疫缺陷的病人，BCG接種還有可能導致結核的全身播散。因此，人們迫切需要一種新的疫苗來替代BCG。為了達到這個目的，人們對結核桿菌的細胞結構進行了深入的研究。研究發(fā)現，其細胞壁的最外層含有結構非常復雜和特殊的糖聚合物，主要包括分枝酸-阿拉伯半乳糖復合物(mAG)和脂肪阿拉伯甘露聚糖(LAM)(Tuberculosis,2003,83:91)。其中，LAM在結核桿菌感染人體細胞的免疫學過程中扮演了非常重要的作用，它能夠促進宿主巨噬細胞中有機體的存活，同時在結核桿菌細胞中LAM是高度保守的(FEMSMicrobiol.Rev.,2011,35:1126)。因此，可以根據LAM的結構特征，設計合成LAM寡糖片段，并將其作為半抗原與蛋白質綴合，來制備復合糖綴合物疫苗。目前，相關的研究工作主要集中在LAM寡糖片段的合成方法學上，只有少數人將寡糖片段與蛋白質連接。PeterH.Seeberger等(J.Am.Chem.Soc.,2008,130:16791)高效的合成了磷脂酰肌醇(PI)和含有1-6個甘露糖苷的磷脂酰肌醇(PIM1-PIM6)，在每一個PIM的還原端都有一個硫醇作為連接基團與血藍蛋白(keyholelimpethemocyanin，KLH)連接，但是，這些糖蛋白的免疫活性測試結果并不理想。DavidR.Bundle等(BioconjugateChem.,2014,25:685)將LAM非還原端阿拉伯分支六糖通過點擊化學反應連接在一個共聚維酮上，這一聚合物是由乙酸乙烯酯和N-乙烯基-2吡咯烷酮通過共聚合反應得到的，然后脫去聚合物上的乙酰基，再通過引入氨基、疊氮以及炔基等功能基團作為墜與糖或肽連接在一起。結果表明，最終的絡合物能夠作為較好的非蛋白抗原，很容易在ELISA板上產生吸附作用，在分析抗體與半抗原的連接方面表現出較好的特性。當前，結核桿菌糖綴合物疫苗的研究仍然停留在試驗階段，有許多問題函待解決。目前，以結核分枝桿菌LAM非還原端含有甘露糖片段的阿拉伯寡糖為半抗原，與載體連接制備結核桿菌復合寡糖綴合物疫苗，尚未見相關文獻報道。
技術實現思路
本專利技術針對現有技術的不足，提供一種結核桿菌LAM寡糖綴合物及其制備方法與應用，其中的寡糖是結核桿菌細胞表面夾膜多糖的寡聚衍生物。本專利技術通過如下的技術方案來實現：一種結核桿菌LAM寡糖綴合物，結構通式如下：其中，寡糖是如下通式(Ⅰ)-(Ⅱ)中的任意一寡糖：式(I)和式(Ⅱ)中，a是0到10中的任意一個整數，b是0到20中的任意一個整數，m是0到10中的任意一個整數，n是0到20中的任意一個整數，c是0或1，d是0或1，e是0或1；X選自：-CH2-、-NH-、-O-、-C(O)-、-S-或之一；連接體是寡糖與載體直接或間接連接后得到的結構部分；t是與載體連接的寡糖的數量，t為1～30中的任意一整數；載體選自：牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、血藍蛋白(KLH)、破傷風類毒素(TT)、白喉毒素無毒突變體(CRM197)、單磷酰化的脂質A(lipidA)、1,2-二硬酯酸-3-磷脂酰乙醇胺或1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺之一。根據本專利技術優(yōu)選的，所述結核桿菌LAM寡糖綴合物的結構通式為如下之一：式中，j1是1到10中的任意一個整數，j2是1到10中的任意一個整數，k是33或35,t是1到30中的任意一個整數。根據本專利技術優(yōu)選的，所述的載體選自：牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、血藍蛋白(KLH)、破傷風類毒素(TT)或白喉毒素無毒突變體(CRM197)之一。根據本專利技術進一步優(yōu)選的，所述結核桿菌LAM寡糖綴合物的結構通式如下：根據本專利技術進一步優(yōu)選的，所述結核桿菌LAM寡糖綴合物的結構通式如下：根據本專利技術進一步優(yōu)選的，所述結核桿菌LAM寡糖綴合物的結構通式如下：上述結核桿菌LAM寡糖綴合物在制備肺結核疫苗中的應用。有益效果本專利技術所述的結核桿菌LAM寡糖綴合物中，寡糖的化學結構是明確且單一的，而非混合物，可通過化學方法合成，它能夠解決卡介苗免疫保護力低的問題，對某些免疫力低下的人群同樣會產生較好的免疫效果，同時能夠避免抗生素的大量使用而帶來的細菌耐藥性的問題。附圖說明圖1是化合物A11的1HNMR譜圖；圖2是A11-KLH寡糖綴合物的特異性抗體滴度圖；圖中kappa代表針對化合物產生的免疫球蛋白中輕鏈為Kappa的免疫球蛋白，IgM代表針對化合物產生的免疫球蛋白中重鏈為μ的免疫球蛋白，IgG1是針對化合物產生的免疫球蛋白中重鏈為γ的免疫球蛋白的一個亞型。具體實施方式為了更好地理解本專利技術的技術方案，下面結合實施例作進一步詳細描述，但本專利技術所保護范圍不限于此。實施例1：通用的合成方法A：糖基化反應取糖基供體(1.2個當量)、糖基受體(1個當量)和分子篩(與供體重量相等)溶于干燥無水的二氯甲烷中，在氮氣氣氛下將反應液降溫至-30℃，攪拌30分鐘，加入N-碘代丁二酰亞胺(NIS，1.2個當量)和催化量的三氟甲磺酸銀(AgOTf)。反應液緩慢升至室溫，待TLC檢測到原料全部反應后用三乙胺中和，過濾除去不溶的固體，濾液旋干，粗品經硅膠柱分離得目標產物(所用洗脫液為石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)，除非另有說明)。B：去乙酰化反應將原料溶于甲醇，攪拌條件下加入1mol/L的甲醇鈉甲醇溶液調節(jié)pH值至10左右，將反應液置于室溫下攪拌反應3小時，TLC檢測至原料全部反應完畢，反應液用酸性樹脂(amberliteIR120)中和，過濾除去酸性樹脂，減壓蒸餾除去溶劑，粗品經硅膠柱分離得目標產物(所用洗脫液為石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)，除非另有說明)。C：脫二甲基叔丁基硅(TBS)保護的反應將原料(1個當量)溶于四氫呋喃，在攪拌條件下加入四正丁基氟化銨(TBAF)的四氫呋喃溶液(1mmol/m本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種結核桿菌LAM寡糖綴合物，結構通式如下：其中，寡糖是如下通式(Ⅰ)?(Ⅱ)中的任意一寡糖：式(I)和式(Ⅱ)中，a是0到10中的任意一個整數，b是0到20中的任意一個整數，m是0到10中的任意一個整數，n是0到20中的任意一個整數，c是0或1，d是0或1，e是0或1；X選自：?CH2?、?NH?、?O?、?C(O)?、?S?或之一；連接體是寡糖與載體直接或間接連接后得到的結構部分；t是與載體連接的寡糖的數量，t為1～30中的任意一整數；載體選自：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血藍蛋白、破傷風類毒素、白喉毒素無毒突變體、單磷酰化的脂質A、1,2?二硬酯酸?3?磷脂酰乙醇胺或1,2?二油酰?SN?甘油?3?磷酰乙醇胺之一。

【技術特征摘要】
1.一種結核桿菌LAM寡糖綴合物，結構通式如下：載體選自：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血藍蛋白、破傷風類毒素、白喉毒素無毒突變體、單磷酰化的脂質A、1...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：郭忠武，王利振，顧國鋒，安蓮，
申請(專利權)人：山東大學，
類型：發(fā)明
國別省市：山東;37