本發明專利技術公開了Kin17基因或蛋白在制備肺癌診斷、預后評估及治療藥劑中的應用，本發明專利技術研究發現，Kin17基因或蛋白可作為肺癌新的診斷標志及藥物靶標，Kin17蛋白在肺癌中的表達明顯升高，維持了腫瘤細胞的快速增殖活性，在肺癌的發生發展中發揮重要作用。沉默肺癌中Kin17的表達能抑制肺癌細胞的增值活性，也能增強肺癌細胞對化療藥物的敏感性。Kin17基因或蛋白可用于肺癌的早期鑒別診斷、患者預后評估及臨床治療。
【技術實現步驟摘要】
Kinl 7基因或蛋白在制備肺癌診斷及治療藥劑中的應用
本專利技術涉及肺癌新的診斷標志及藥物靶標，具體涉及Kinl7基因或蛋白在制備肺癌診斷、預后評估及治療藥劑中的應用。
技術介紹
肺癌是目前全球范圍內發病率與致死率最高的惡性腫瘤，每年的新發肺癌病例有160萬，占所有惡性腫瘤的13%，每年因肺癌導致的死亡患者有140萬，占所有惡性腫瘤死亡的18%，嚴重危害著人類的生命健康。肺癌的惡性程度較高，易復發、轉移，絕大多數患者在確診時已屬相對晚期，失去了根治性手術的機會。早期診斷和及早治療對肺癌患者的療效與預后至關重要。對于肺癌高危人群的篩查，一般根據病人的胸部癥狀、影像學檢查(如X線胸片、CT、MR1、PET-CT等)和血液中腫瘤標志物(如CEA、CA125、NSE和CYFRA2121等)等。目前這些篩查指標還不夠理想。很多肺癌患者在手術后易復發，而且外科手術和放療都是局部治療方式，無法控制肺癌的晚期轉移。化療是對晚期轉移性癌癥患者的最主要治療手段。但常規的細胞毒性化療藥缺乏腫瘤細胞特異性，在殺死腫瘤細胞的同時，也殺傷了骨髓及其他增殖旺盛的正常細胞，不良反應嚴重；而且多次化療后產生的耐藥性也讓化療的療效已經到達了平臺期。為了進一步提高晚期肺癌的治療效果，近年來靶向治療方法越來越受到推崇。分子靶向治療方法特異性強，細胞毒性小，在治療晚期肺癌上具有獨有的優勢。雖然目前很多靶向藥物的出現給肺癌患者帶來了希望，但也在臨床應用中存在著藥物適用對象不廣、單藥療效不強、與化療藥協同作用不佳、耐藥性與不良反應嚴重等諸多問題。 肺癌癌細胞具有旺盛的增殖力、持續的DNA復制潛能和蓄積的DNA損傷。Kinl7蛋白是一個在物種進化過程中十分保守的蛋白質，它主要與細胞的DNA復制、DNA修復及細胞增殖功能有關，在人體各組織器官中表達普遍較低。目前，關于Kinl7基因或蛋白肺癌新的診斷標志及藥物IE標還末見報道。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供Kinl7基因或蛋白在制備肺癌診斷、預后評估及治療藥物中的應用。專利技術人研究發現，Kinl7蛋白在肺癌中的表達明顯升高，維持了腫瘤細胞的快速增殖活性，在肺癌的發生發展中發揮重要作用。因此，Kinl7基因(核苷酸序列見SEQ IDNO:1)或蛋白(氨基酸序列見SEQ ID NO:2)可作為肺癌新的診斷標志及藥物靶標，Kinl7基因或蛋白可用于肺癌的早期鑒別診斷、肺癌患者的預后評估分析及臨床治療。【附圖說明】圖1:Kinl7在肺癌患者標本與良性病變患者標本中的表達情況； 圖2:Kinl7在肺癌標本的癌巢組織與A549細胞系中的表達明顯高于癌旁正常組織； 圖3:重組質粒pET32a-KIN17中插入的Λ7Λ77基因的部分測序圖；圖4:1PTG誘導Kinl7蛋白在大腸桿菌中原核表達的SDS-PAGE電泳圖； 圖5:純化后的His標簽Kinl7蛋白的SDS-PAGE電泳圖(左)與Western_blot鑒定圖(右)； 圖6:用siRNA_Kinl7下調Kinl7表達(左)，抑制了肺癌A549細胞的生長增殖活性(右)； 圖7:用siRNA_Kinl7剔降Kinl7，能增強化療藥卡鉬對肺癌A549細胞增殖的抑制作用。【具體實施方式】Kinl7基因或蛋白的定名與序列 編碼Kinl7蛋白的基因定名為“KIN17基因”，KIN17基因編碼的蛋白定名為“Kinl7蛋白”，KIN17基因的登錄號為:NM_012311。KIN17基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。Kin17蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。下面結合具體的實驗對本專利技術作進一步的說明，但并不局限于此。 Kinl7基因或蛋白應用于肺癌診斷: 隨機選取施行手術活檢并經病理學診斷的肺癌患者90例(其中非小細胞患者65例、小細胞肺癌患者25例)和和良性病變(如肺炎與肺纖維化等)患者40例，用免疫組化方法檢測Kinl7在這些患者病理標本中的表達情況。免疫組化檢測的步驟: 1)組織切片脫蠟至水，置于0.01M檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中，100°C微波抗原修復處理20min，自然冷卻至室溫； 2)蒸餾水沖洗后，滴加3%H202孵育15min;然后用0.01M磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)沖洗3次，每次3min ； 3)滴加1: 150稀釋的Kinl7抗體(購自Santacruz)，37°C孵育60min后，用PBS沖洗3次,每次3min ； 4)接著滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記的EnVision?二抗試劑(購自Dako公司)，37°C孵育30min后，用PBS沖洗3次，每次3min。最后用3，3’ - 二氨基聯苯胺(DAB)顯色3min, Mayer蘇木素復染3min ； 5)梯度酒精脫水、透明、封固。染色評分:分別就每張切片的染色強度(一，±，I +，2 +，3 +，4十)與陽性細胞的百分率(0-100)%進行打分。計算染色得分=染色強度(0，0.5，1，2，3，4)X (0-100)。如，某張玻片的染色強度是2 +，陽性細胞的百分率是65%，那得分等于2X60=130。得分(100定義為低表達，得分> 100定義為高表達。全部切片由兩個病理科醫生在不知道組織診斷性質的情況下獨立打分。根據染色評分結果對數據進行統計分析。結果顯示，Kinl7在肺正常組織及良性病變組織中的表達較低，而在肺癌標本中表達明顯異常升高0° <0.01);腫瘤細胞增殖越旺盛的組織部位，Kinl7的表達越強(圖1)。用Western blot方法檢測Kinl7在肺癌患者新鮮組織與A549細胞中的表達，發現Kinl7在肺癌標本的癌巢組織與A549細胞系中的表達明顯高于癌旁正常組織(圖2)。因此，采用免疫組化、免疫熒光和實時定量PCR等方法對患者的肺病變組織中的Kinl7蛋白或基因表達進行檢測，有助于鑒別診斷肺良性病變與肺癌病情診斷。Kinl7蛋白的制備 純化Kinl7蛋白是制備Kinl7抗體及相關的診斷試劑的重要材料。為了研發基于Kinl7表達的肺癌診斷試劑，采用如下方法制備Kinl7蛋白。1.先用引物 Pl (5，-CGGGATCCATGGGGAAGTCGGATTTTCT-3’，SEQ ID NO:3)和 P2(5’ - CGTAAGCTTTCAGGCAAGTTTAGAAATGTCTTC-3’，SEQ ID NO:4)從細胞中 PCR 擴增基因開放閱讀框全長，經用內切酶及?HI和歷id分別進行雙酶切反應后，插入到pET32a-c (+)載體中，測序分析(圖3)證明成功構建pET32a-KIN17重組質粒； 2.將重組質粒轉化入大腸桿菌表達菌BL21中，再用IPTG誘導表達攜帶His標簽的Kinl7蛋白，經SDS — PAGE電泳分離及考馬斯亮藍染色后，發現目的蛋白的表達較好(圖4)； 3.接著利用N1-NTAHis-Bind柱進行親和層析來純化Kinl7蛋白。純化終產物經SDS-PAGE電泳分析顯示，一個和His標簽Kinl7蛋白大小一致的蛋白條帶純度很高，達到95%以上(如圖5左);該主要條帶經Western blot方法鑒定為Kinl7目的蛋白(圖5右)。Kinl7基因或蛋白應用于肺癌患者的本文檔來自技高網...
【技術保護點】
用于檢測Kin17基因的方法在制備肺癌診斷或預后評估試劑中的應用。
【技術特征摘要】
2013.05.07 CN 201310164095.61.用于檢測Kinl7基因的方法在制備肺癌診斷或預后評估試劑中的應用。2.檢測Kinl7蛋白表達水平的方法在制備肺癌診斷或預后評估試劑中的應用。3.抑制Kinl7蛋白表達的制劑在制備治療肺癌或改善肺癌患者病情藥物中的...
【專利技術屬性】
技術研發人員：曾濤，
申請(專利權)人：曾濤，
類型：發明
國別省市：廣東;44
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