能降解2,4–滴丁酯和敵敵畏的菌株及其制備修復菌劑的方法技術

本發明專利技術公開了一種能降解2,4–滴丁酯和敵敵畏的菌株及其制備修復菌劑的方法，所述菌株為革蘭氏陰性菌，顯微鏡下可見菌株菌體為短桿狀。透射電鏡下，具有極生鞭毛。在LB平板上培養菌落呈圓形、油滴狀、黃色、不透明，表面濕潤、粘稠，邊緣整齊。在短時間內對2,4-滴丁酯和敵敵畏降解率分別為99.82%和99.65%，該菌株為Pseudomonassp.LT1菌株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC?No.7947。該菌株可用于上述農藥的生物降解，以及農藥污染的土壤及農產品的生物修復和生物凈化。

【技術實現步驟摘要】
能降解2, 4 -滴丁酯和敵敵畏的菌株及其制備修復菌劑的方法
本專利技術屬于化學農藥生物降解
,涉及一株土生細菌Pseudomonas sp.LTl菌株，及其對農藥2，4 -滴丁酯和敵敵畏的降解作用，可用于土壤農藥污染的原位修復工程。
技術介紹
農、獸藥是目前世界各國防治農作物病蟲害和養殖業病害的有效手段。大量化學農、獸藥，特別是高毒、高殘留農獸藥的使用，成為食品安全和危害人們健康的主要“殺手”。目前，主要使用的化學農藥按其功能不同，主要分為殺蟲劑(Insecticide)、除草劑(Herbicide)和殺菌劑(Fungicide)三大類。依據化學結構不同，可分為有機氯類、有機磷類、擬除蟲菊脂類、氨基甲酸脂類和無機農藥等多種類型。這些化學農藥的共同特點是:①有毒性，且靶向性差殘留性，一般分為高殘留、中殘留和低殘留等；③遷移性和累積性，可通過空氣、土壤或地下水發生遷移，甚至在生物體內累積。有機磷類殺蟲劑成為目前使用量最大的農藥之一，多屬于高效農藥。目前，有機磷農藥包括甲拌磷、乙拌磷、內吸磷、對硫磷、甲胺磷、乙酰甲胺磷、殺螟硫磷、特普、敵百蟲、樂果、馬拉硫磷、甲基對硫磷、二甲硫吸磷、敵敵畏、甲基內吸磷、氧化樂果、久效磷等。有機氯農藥有滴滴涕、六六六、林丹、甲氧、高殘毒DDT、 硫丹。常用的擬除蟲菊脂類農藥有溴氰菊脂、氯氰菊脂、氯菊脂、胺菊月旨、甲醚菊脂等。氨基甲酸酯類有西維因、葉蟬散、涕滅威、呋喃丹和異索威等。在我國的農藥品種結構中，具有高毒和“三致性”的殺蟲劑占全部農藥的40%以上，我國農藥劇毒、高毒農藥品種居多，存在著“3個70%”，即:農藥中殺蟲劑占70% ;殺蟲劑中有機憐類品種占70% ;有機憐類中少數幾個聞毒品種占70%。目前，世界上有機憐農藥(Organophosphorus pesticides, OPs)的種類已達150多種，成為使用量最大的農藥之一，我國生產的有機磷農藥的品種就有20余種，年產量超過IOOkt,占我國農藥總產量的80%以上。據統計，我國施用農藥面積在218億hm2以上，每年用量50~60萬噸。這些施用的農藥，有50%~60%殘留于土壤。目前，我國約有87~107萬hm2的農田土壤受到有機磷農藥嚴重污染，危害也越來越大。主要表現為:一是有機磷農藥在殺死靶標生物的同時，也或多或少地殺死非靶標生物，對周圍環境乃至整個生態環境造成嚴重的破壞。二是土壤中有機磷的成分含量過高，通過糧食、蔬菜、水果等間接影響人體和動物的健康。有機磷農藥對人體的危害不僅表現在干擾人體化學信息的傳遞，破壞身體的酶，而且它阻礙器官發揮正常的生理功能，導致神經系統功能失調。癌癥、不孕癥、內分泌紊亂等疾病均與有機磷農藥污染有關。三是有機磷農藥對土壤微生物數量、種群結構和生物活性產生嚴重影響，造成土壤生產力下降。土壤微生物是調節土壤肥力的重要因素。高毒性有機磷農藥的不斷使用，破壞了土壤微生物的繁殖，使敏感性的菌種受到抑制，土壤微生物的多樣性遭到破壞，種群趨于單一化，引起原有的平衡紊亂功能失調從而影響土壤物質和能量的循環，影響土壤微生物的氨化硝化和呼吸作用等，由此破壞了土壤結構和理化性質，土地肥力持續下降。為治理有機磷農藥對生態環境的危害，各國的研究人員做了大量的農藥降解方法研究，建立了生物降解、化學降解、光化學降解、超聲波、洗滌劑和電離輻射等。而土壤中有機磷農藥污染的治理主要是通過微生物降解有機磷農藥。從上個世紀60年代開始，在污染物降解菌的分離、污染土壤微生物多樣性以及微生物中污染物降解基因的克隆等方面均有一定的研究。到目前為止，已分離到多種降解有機磷農藥微生物，包括細菌、放線菌、真菌及藻類，其中細菌和真菌最多，細菌研究的較為透徹。細菌中優勢菌主要為假單胞菌、芽胞桿菌、產堿桿菌、無色桿菌、黃桿菌等，真菌主要是霉菌。有的微生物專一降解某種農藥，表現出降解惰性，如節桿菌和氣桿菌等。有的能同時降解多種農藥，比較典型的有假單胞菌和芽胞桿菌等，可降解同類農藥的多種品種或不同類型農藥品種。有的不直接降解農藥，而是通過共代謝完成降解過程。許多研究 者從自然土壤和環境中分離或篩選了大量的農藥降解菌，如從長期使用毒死蜱的土壤中分離了一株可降解毒死蜱的真菌曲霉和一株可降解毒死蜱和甲胺磷的真菌木霉；通過富集培養和亞硝基肌誘變處理得到一株降解甲胺磷活性較高的華麗曲霉，它同時能降解樂果和對硫磷等有機磷農藥；分離得到一株能以甲胺磷為唯一碳源、氮源和能源生長的曲霉M-2;從農藥廠污泥中分離得到一株具有較高降解氧樂果活性的黑曲霉；從污泥中分離得到一株可降解樂果的不動菌屬菌株，它以共代謝方式降解樂果，還能降解敵敵畏和對硫磷等農藥；還分離得到一株能降解甲胺磷、敵敵畏和對硫磷的地衣芽抱桿菌。這些研究大大豐富了有機磷農藥降解菌陣營。但是，據《國際微生物學會聯盟通訊》有關專家估計，全球約有50萬~60萬種微生物，而今已被研究和記載的還不到5%，在如此豐富的微生物資源庫中，由于自然環境及其它理化條件的差異，尤其是長期受農藥脅迫的環境中，仍有很多能降解農藥的微生物未被發現，現在分離到的還只是滄海一粟。因此，降解農藥的微生物還需進一步的發現和研究。研究發現新的農藥降解菌，可豐富降解農藥微生物的種類，為土壤生物修復技術的研究和應用提供依據，為構建有機磷降解高效工程菌提供新的資源，推進生物修復工程的發展，造福人類具有重要意義。
技術實現思路
本專利技術從土壤樣本中分離篩選得到一株對2，4 -滴丁酯和敵敵畏具有高效降解能力的細菌菌株；本專利技術提供該菌株的鑒定特征和16S rDNA序列、菌株的分離篩選、菌株的生理生化特征、菌株對2，4-滴丁酯和敵敵畏的降解作用。本專利技術在發現和確定該菌株對2，4 -滴丁酯和敵敵畏具有高效降解特性的基礎上，還提供應用該菌株降解土壤中2，4 -滴丁酯和敵敵畏菌劑發酵的方法。本專利技術的技術方案概述如下:能降解2，4-滴丁酯和敵敵畏的菌株，該菌株為革蘭氏陰的假單胞菌屬，命名為Pseudomonas sp.LTl菌株，于2013年7月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編 100101 ;保藏號為 CGMCC N0.7947。所述的能降解2，4 -滴丁酯和敵敵畏的菌株，該菌株16S rDNA序列為SEQ ID N0.1所示。所述的能降解2，4 -滴丁酯和敵敵畏的菌株制備修復菌劑的方法，步驟如下:步驟一,將Pseudomonas sp.LTl菌株接種于LB培養基中，振蕩培養至對數期；步驟二，將步驟一培養好的種子液按照體積比為10%接種于種子罐的培養基中，通入無菌空氣，振蕩培養至對數期；步驟三，將步驟二培養后的種子液以體積比10%接種入生產罐發酵培養至菌體數量達到8億個/ml以上。所述的能降解2，4 -滴丁酯和敵敵畏的菌株制備修復菌劑的方法，步驟一中振蕩培養條件可以為30°C，100轉/小時。所述的能降解2，4 -滴丁酯和敵敵畏的菌株制備修復菌劑的方法，步驟二中振蕩培養條件可以為30°C，180轉/分鐘。所述的能降解2，4 -滴丁酯和敵敵畏的菌株制備修復菌劑的方法，步驟二中無菌空氣的通入量可以為0.55-0.65m3/分鐘。所述能降解2，4-本文檔來自技高網...

【技術保護點】
能降解2,?4–滴丁酯和敵敵畏的菌株，其特征在于，該菌株為革蘭氏陰的假單胞菌屬，命名為Pseudomonas?sp.LT1菌株，保藏號為CGMCC?No.?7947。

【技術特征摘要】
1.能降解2，4-滴丁酯和敵敵畏的菌株，其特征在于，該菌株為革蘭氏陰的假單胞菌屬，命名為 Pseudomonas sp.LTl 菌株，保藏號為 CGMCC N0.7947。2.根據權利要求1所述的能降解2，4-滴丁酯和敵敵畏的菌株，其特征在于，該菌株16S rDNA 序列為 SEQ ID N0.1 所示。3.權利要求1所述的能降解2，4-滴丁酯和敵敵畏的菌株制備修復菌劑的方法，其特征在于，步驟如下: 步驟一,將sp.LTl菌株接種于LB培養基中,振蕩培養至對數期； 步驟二，將步驟一培養好的種子液按照體積比為10%接種于種子罐的培養基中，通入無菌空氣，振蕩培養至對數期； 步驟三，將步驟二培養后的種子液以體積比10%接種入生產罐發酵培養至菌體數量達到 8億個/ml以上。4.根據權利...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李同祥，孫會剛，黃天姿，候進慧，王陶，懂玉瑋，高兆建，劉全德，王慶芝，
申請(專利權)人：徐州工程學院，
類型：發明
國別省市：江蘇;32