本發明專利技術涉及一種大規模高密度生產豬圓環病毒2型抗原的方法。本發明專利技術使用生物反應器微載體懸浮培養工藝代替現有轉瓶培養工藝生產豬圓環病毒2型抗原，該方法可以大量降低生產成本和提高產量，相比轉瓶工藝單位抗原成本降低80％～90％，生產周期減少7天，產量提高3～10倍；因為其可以多次收獲抗原，因而較傳統反應器培養工藝單位抗原成本降低40％～50％，產量提高3～5倍，此發明專利技術生產的抗原無血清殘留，生產的疫苗安全性更高，同時制品的批間差異小，質量穩定易于控制，可明顯提高制品的產量及質量。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種應用生物反應器微載體懸浮培養技術大規模高密度生產豬圓環病毒2型疫苗抗原的方法，屬于獸用生物制品領域。
技術介紹
目前，豬圓環病毒2型(Porcine circovirus2，PCV2)疫苗抗原生產主要采用細胞轉瓶培養方法，少數采用細胞懸浮培養方法，轉瓶工藝生產半成品抗原病毒含量較低，僅為104_5~6 °TCID50/ml，不能提供 穩定合格抗原(合格抗原每毫升抗原含量應≥105_ 5TCID50)，需要進行高倍濃縮。且轉瓶工藝勞動強度大，生產一批需要100~200個轉瓶，需多人同時進行長時間的消化傳代操作，增加污染風險；生產周期長，需要10天；效率較低，每次培養只能收獲一次；培養基中含有一定濃度的牛血清，抗原雜蛋白比較多，易造成應激反應；生產成本較高，人工、場地及原料費用大；對環境要求較高，需要較大的場地和GMP廠房；不同生產批次及同一生產批次的轉瓶之間存在較大差異，容易造成批內及批間的抗原質量差異，進而影響疫苗質量的穩定性；轉瓶清洗需要大量水，并且產生的含毒廢水需要專門處理，容易對環境造成污染，如處理不當會造成生物安全和公共衛生問題。而普通細胞微載體懸浮培養工藝，較轉瓶工藝雖有提高，但仍存在較大改進空間，傳統微載體懸浮培養工藝，其生產周期仍需6~7天，且每次培養只能收獲I次；仍依靠轉瓶提供帶毒細胞，無法避免轉瓶清洗產生的帶毒廢水，另傳統轉瓶工藝及傳統反應器微載體懸浮培養工藝，其生產的抗原中存在較高含量的血清，所產疫苗，會使動物機體產生不同程度的不良反應。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服現有轉瓶培養法及傳統細胞懸浮微載體培養法的不足之處，提供一種應用反應器微載體懸浮培養技術大規模高密度生產豬圓環病毒2型疫苗抗原的方法。該方法可以大量降低生產成本和提高產量，相比轉瓶工藝單位抗原成本降低80%~90%，生產周期減少7天，產量提高3~10倍；較傳統反應器培養工藝單位抗原成本降低40%~50%，產量提高3~5倍，因為其可以收獲抗原多次。且該工藝占地小，可迅速進行規模化生產，對環境要求較低，自動化程度高，人工成本少，生產批間差異小，質量穩定易于控制，可明顯提高產品的產量及質量。為了實現上述指標，本專利技術采取了如下技術方案:，該方法包括如下步驟:(I)種子細胞的制備將無菌生理鹽水預熱處理，使用預熱后的生理鹽水洗滌長滿單層的健康克隆細胞PK-15W作為種細胞，加入20~40ml胰酶進行消化，消化期間，時刻觀察細胞層變化，待細胞層呈白色霧狀并部分脫落時，加入含有伴刀豆球蛋白A和D-氨基葡萄糖的有血清低糖DMEM的細胞生長液，種子細胞終止消化，迅速搖動轉瓶，使壁上細胞脫落，反復吹打分散細胞后，按照1:3至1:5的傳代比例分瓶；(2)制苗細胞的制備根據最終培養體積稱取Cytodex-1微載體，使其終濃度為5~10g/L，用PBS進行浸泡清洗，滅菌后，在攪拌式生物反應器中使用細胞生長液進行平衡，備用；選取生長狀態良好的種子細胞接種生物反應器，接種密度為I~5X105個/ml ;(3)接毒隨后，以最終培養體積的3%~8%接種PCV2種毒；接種后，設定反應器控制條件為:ΡΗ7.0~7.4，DO為20%~80%，攪拌速度為80~120r/min ；(4)病毒的收獲和含量測定待細胞在前述條件下，細胞生長液中培養48~72h后靜置，排出上清，加入含有伴刀豆球蛋白A和水解酪蛋白的無血清低糖DMEM細胞維持液，調整反應器控制條件為:pH7.0~7.4，DO為20 %~80 %，攪拌速度為100r/min~180r/min，繼續維持48~72h后靜置,進行第一次上清收獲，觀察細胞狀態，如細胞狀態良好則補加與收獲上清等量的新鮮細胞維持液，在PH7.0~7.4，DO為20%~80%，攪拌速度為IOOr/min~180r/min的條件下繼續培養48~72h后靜置，進行第二次上清收獲，重復此過程直至微載體上的細胞全部脫落，結束整個培養過程，收獲上清后，將微載體進行回收處理，并將收獲的抗原反復凍融3次后作為半成品，進行病毒含量測定。(5)用以上所述的豬圓環病毒2型抗原半成品制備疫苗。(6)用以上所述的豬圓環病毒2型抗原半成品制備疫苗的方法，包括:將PCV2株在PK-15W細胞中大量增殖，經甲醛滅活后加入常用佐劑進行乳化，制備常規的佐劑疫苗。【具體實施方式】采用生物反應器作為培養設備、微載體作為支持細胞生長的載體、克隆細胞PK-15W(原名PK-15B1，CCTCC N0.C200936)作為制苗細胞、PCV2作為制苗種毒；采用含有伴刀豆球蛋白A和D-氨基葡萄糖的低糖DMEM作為制苗細胞生長液；采用含有伴刀豆球蛋白A和水解酪蛋白的無血清低糖DMEM作為制苗細胞維持液；并包括如下步驟:(I)種子細胞培養利用預熱的無菌生理鹽水將長滿的種子細胞單層洗滌一次，加入20~40ml胰酶消化液消化，不斷轉動轉瓶直至細胞全部脫落，加入細胞生長液終止消化，混勻，按照1:3至1:5的傳代比例分瓶；(2)種子細胞制備接毒I)生物反應器的準備根據培養的體積選擇合適的生物反應器，連接好各種管道、補料和輔助罐，換液接口，接上溫度、pH、DO電極，進行電極的校正；2)微載體的準備根據培養的體積和微載體濃度稱取Cytodex-1微載體于已娃化處理的玻璃瓶中，加入40~50倍微載體質量的PBS緩沖液浸泡lh，此后更換新鮮的PBS緩沖液繼續浸泡過夜；更換30倍體積的PBS緩沖液于玻璃瓶或生物反應器中準備滅菌；3)滅菌滅菌前認真檢查各管道和接頭確保連接完好后進行氣密性測試，測試合格后方可準備進行滅菌；根據生物反應器的規模，IOL以下離線滅菌，在高壓鍋中121°C高壓30min，滅菌結束后自然冷卻；10L以上的反應器采用在位滅菌的方式。4)制苗細胞培養在生物反應器中將Cytodex-1微載體的濃度設定為5~10g/L，并使用制苗細胞生長液進行平衡備用；挑選生長狀態良好的種子細胞接種生物反應器，接種密度為I~5X105個/ml，37°C培養(見圖2中的圖A)。(3)接毒 約在細胞接入反應罐培養8~10小時，取樣鏡檢可見接入細胞全部貼在微載體上時(見圖2中的圖B)，按照細胞培養液體積的3%~5%接種接入豬圓環病毒2型種毒；接種后采用制苗細胞生長液在37°C、pH 7.0~7.4、D02 0%~80%、攪拌轉速80~120r/min的條件下繼續培養；(4)病毒的收獲和含量測定待細胞在前述制苗細胞生長液，pH 7.0~7.4，DO 20 %~80 %，攪拌轉速80~120r/min的條件下培養48~72h(見圖2中圖C和圖D)后，靜置，放出上清，更換制苗細胞維持液，在pH 7.0~7.4，DO 50%~70%，攪拌轉速100~180r/min的條件下繼續培養48~72h，靜置后，放出上清收獲，觀察若細胞大部分已脫落則連同微載體一起全部收獲，若細胞狀態良好則繼續收獲上清，并再次加入制苗細胞維持液繼續培養48~72h后靜置，吸出上清收獲，重復此過程直至大部分細胞從微載體上脫落，將收獲的抗原反復凍融2~3次后作為半成品，進行病毒含量測定。病毒含量測定采用IFA測定法，即將PCV2病毒液作KT1到10_8倍比稀釋后用維持液分別接種于長滿單層的PK15-W細胞，每個本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種大規模高密度生產豬圓環病毒2型抗原的方法，該方法包括如下步驟：(1)種子細胞的制備將無菌生理鹽水預熱處理，使用預熱后的生理鹽水洗滌長滿單層的健康克隆細胞PK?15W作為種細胞，加入20～40ml胰酶進行消化，消化期間，時刻觀察細胞層變化，待細胞層呈白色霧狀并部分脫落時，加入含有伴刀豆球蛋白A和D?氨基葡萄糖的有血清低糖DMEM的細胞生長液，種子細胞終止消化，迅速搖動轉瓶，使壁上細胞脫落，反復吹打分散細胞后，按照1:3至1:5的傳代比例分瓶；(2)制苗細胞的制備根據最終培養體積稱取Cytodex?1微載體，使其終濃度為5～10g/L，用PBS進行浸泡清洗，滅菌后，在攪拌式生物反應器中使用細胞生長液進行平衡，備用；選取生長狀態良好的種子細胞接種生物反應器，接種密度為1～5×105個/ml；(3)接毒隨后，以最終培養體積的3％～8％接種PCV2種毒；接種后，設定反應器控制條件為：pH7.0～7.4，DO為20％～80％，攪拌速度為80～120r/min；(4)病毒的收獲和含量測定待細胞在前述條件下，細胞生長液中培養48～72h后靜置，排出上清，加入含有伴刀豆蛋白A和水解酪蛋白的無血清低糖DMEM細胞維持液，調整反應器控制條件為：pH7.0～7.4，DO為20％～80％，攪拌速度為100r/min～180r/min，繼續維持48～72h后靜置，進行第一次上清收獲，觀察細胞狀態，如細胞狀態良好則補加與收獲上清等量的新鮮細胞維持液，在pH7.0～7.4，DO為20％～80％，攪拌速度為100r/min～180r/min的條件下繼續培養48～72h后靜置，進行第二次上清收獲，重復此過程直至微載體上的細胞全部脫落，結束整個培養過程，收獲上清后，將微載體進行回收處理，并將收獲的抗原反復凍融3次后作為半成品，測定其病毒含量。...
【技術特征摘要】
1.一種大規模高密度生產豬圓環病毒2型抗原的方法，該方法包括如下步驟: (1)種子細胞的制備將無菌生理鹽水預熱處理，使用預熱后的生理鹽水洗滌長滿單層的健康克隆細胞PK-15W作為種細胞，加入20~40ml胰酶進行消化，消化期間，時刻觀察細胞層變化，待細胞層呈白色霧狀并部分脫落時，加入含有伴刀豆球蛋白A和D-氨基葡萄糖的有血清低糖DMEM的細胞生長液，種子細胞終止消化，迅速搖動轉瓶，使壁上細胞脫落，反復吹打分散細胞后，按照1:3至1:5的傳代比例分瓶； (2)制苗細胞的制備根據最終培養體積稱取Cytodex-1微載體，使其終濃度為5~10g/L,用PBS進行浸泡清洗，滅菌后，在攪拌式生物反應器中使用細胞生長液進行平衡，備用；選取生長狀態良好的種子細胞接種生物反應器，接種密度為I~5X105個/ml ; (3)接毒隨后，以最終培養體積的3%~8%接種PCV2種毒；接種后，設定反應器控制條件為:ρΗ7.0~7.4，DO為20%~80%，攪拌速度為80~120r/min ； (4)病毒的收獲和含量測定待細胞在前述條件下，細胞生長液中培養48~72h后靜置，排出上清，加入含有伴刀豆蛋白A和水解酪蛋白的無血清低糖DMEM細胞維持液，調整反應器控制條件為:pH7.0~7.4，DO為20%~80%，攪拌速度為100r/min~180r/min，繼續維持48~72h后靜置,進行第一次...
【專利技術屬性】
技術研發人員：董彥鵬，孫石靜，何葉峰，繆芬芳，何海蓉，張志華，胡芳，
申請(專利權)人：江蘇南農高科技股份有限公司，
類型：發明
國別省市：江蘇;32
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