在原核細胞周質中產生多肽的方法技術

本發明專利技術報道了用于產生多肽的方法，所述方法包括約25℃下，在溶液中孵育(重懸)原核細胞約15分鐘至約6小時的步驟，所述溶液包含約10mM至約95mM的Tris-HCl和約2mM至約6mM的EDTA，所述溶液的pH值約7至約10。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】在原核細胞周質中產生多肽的方法本文報道了在原核細胞中產生多肽的方法，其中使用存在螯合劑的緩沖系統中的孵育步驟，在確定pH值和溫度值下，從原核細胞周質中回收重組產生的多肽。
技術介紹
具有合適的信號序列時，重組產生的多肽可以被分泌到大腸桿菌細胞的周質間隙中(Joly,J.C.和Laird,M.W.,Periplasm編著，Ehrmann,M.,ASM印制,WashingtonD.C.,(2007)345-360)。在化學氧化環境中二硫鍵形成，由此有利于多肽在功能上的正確折疊。這些多肽從周質間隙中的選擇性分離是所希望的，以避免來自大腸桿菌的宿主細胞蛋白(HCP)的污染。由此，有利于隨后的多肽純化。示例性分離方法是如Ren,G.等,J.ofBacteriology189(2007)2777-2786所描述的滲壓沖擊。使用該方法，溶解于TRIS緩沖液(pH為7.2)中的EDTA使原核細胞外膜去穩定，這使得蔗糖滲透到周質間隙。蔗糖是不能透過內膜的。之后通過離心除去TRIS-EDTA緩沖液中，將細胞迅速重懸于冰冷的蒸餾水中。由此水浸入充滿蔗糖的周質間隙，通過周質體積的增加使不穩定的外膜崩解。添加氯化鎂重新穩定外膜。可以在Humphreys,D.P.(ThePeriplasm(編著)Ehrmann,M.，第361-388頁，Washington,D.C.:ASM印制(2007))和Middelberg,A.P.(Biotechnol.Adv.13(1995)491-551)中找到其他方法。根據Joly和Laird(見上文)，“當培養體積達到或高于10升時，以小規模分離周質級分(fraction)的常規方法(如原生質體或滲壓沖擊處理)實際上不能完成”。“從外部介質回收蛋白或在僅破壞外膜和肽聚糖后回收蛋白仍然是尚未在大規模上付諸實踐的一個目標”(第354頁)。在WO2012/013930中報道了，從表達重組蛋白和二硫化物異構酶DsbC的革蘭氏陰性細菌宿主細胞的樣品或提取物純化重組蛋白，包括調節樣品或提取物的pH值以沉淀和分離DsbC。在WO01/94585中報道了特異于人腫瘤壞死因子(TNF)-α的新型抗體對于治療TNF-α介導的疾病是有用的，例如，充血性心力衰竭、敗血癥或內毒素性休克、惡病質和成人呼吸窘迫綜合癥。在美國2005/048056中報道了制備具有重鏈和輕鏈的腫瘤壞死因子-α抗體，包括發酵細胞混合物、形成細胞沉淀、并允許沉淀持續放置一段時間。在WO2007/106120中報道了調節肽分子組織，分布包括向組織施用包含血清白蛋白結合肽的綴合物分子。在WO01/45746中報道了對免疫球蛋白(Ig)G、IgM和/或人血清白蛋白具有親和性的肽配體可被綴合，并用于延長活性劑從循環中清除的半衰期。在美國2004/001827中報道了調節肽分子的組織分布，用于增強治療功效并減少副作用，其包括向組織施用包含肽的配體結構域和活性結構域的綴合物分子。
技術實現思路
在本專利技術中已經發現，通過在室溫下使細胞接觸pH值約為8的含有緩沖劑(如Tris)和螯合劑(如EDTA)的溶液、或孵育細胞與pH值約為8的含有緩沖劑(如Tris)和螯合劑(如EDTA)的溶液，可以從原核細胞的周質中分離重組產生的多肽。該方法能夠在大規模生產過程中以高產率和純度分離重組產生的多肽。分離的多肽對下游處理(例如純化)顯示出良好的可行性。如本文中所報道的一個方面是用于產生多肽的方法，所述方法包括在溶液中孵育原核細胞約15分鐘至約6小時的步驟，所述溶液包含約10mM至約95mM的緩沖劑和約0.5mM至約9.5mM的螯合劑，所述溶液的pH值約7至約10。在一個實施方案中，螯合劑選自乙二胺、次氮基三乙酸(NTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、1,2-雙(鄰-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N'，N'-四乙酸(BAPTA)、乙二胺-N，N'-二琥珀酸(EDDS)、膦酸鹽(如乙二胺四(亞甲基膦酸)EDTMP或二亞乙基五(亞甲基膦酸)DTPMP)、檸檬酸、卟啉類化合物(如血紅素、葉綠素或維生素B12)。在一個實施方案中，螯合劑是乙二胺四乙酸(EDTA)。如本文所報道的一個方面是用于產生多肽的方法，所述方法包括在約25℃在溶液中孵育(重懸)原核細胞約15分鐘至約6小時的步驟，所述溶液包含約10mM至約95mM的Tris-HCl和約2mM至約6mM的EDTA，所述溶液的pH值約7至約10。如本文所報道的一個方面是用于產生多肽的方法，所述方法包括在約25℃在溶液中孵育(重懸)原核細胞約15分鐘至約6小時的步驟，所述溶液包含約10mM至約95mM的Tris-HCl和約2mM至約4mM的EDTA，所述溶液的pH值約7至約10。在一個實施方案中，螯合劑的濃度為約1mM至約6mM。在一個實施方案中，螯合劑的濃度為約1mM至約4mM。在一個實施方案中，螯合劑的濃度為約1mM至約3mM。在一個實施方案中，螯合劑的濃度為約2mM至約6mM。在一個實施方案中，螯合劑的濃度為約2mM至約4mM。在一個實施方案中，螯合劑的濃度為約2mM。在一個實施方案中，螯合劑的濃度為約4mM。在一個實施方案中，螯合劑的濃度為約6mM。在一個實施方案中，EDTA的濃度為約0.5mM至9.5mM。在一個實施方案中，EDTA的濃度為約1mM至約3mM。在一個實施方案中，EDTA的濃度為約2mM。在一個實施方案中，EDTA的濃度為約4mM。在一個實施方案中，EDTA的濃度為約6mM。在一個實施方案中，本專利技術所報道的方法的特征在于，所述EDTA的濃度為約2mM。在一個實施方案中，本專利技術所報道的方法的特征在于，所述EDTA的濃度為約4mM。在一個實施方案中，本專利技術所報道的方法的特征在于，所述EDTA的濃度為約6mM。在一個實施方案中，溶液具有約7.5至約8.5的pH值。在一個實施例中，本專利技術所報道的方法的特征在于，pH值約為8。在一個實施方案中，孵育時間為約20分鐘至約3.5小時。在一個實施例中，本專利技術所報道的方法的特征在于，孵育時間是約30分鐘。在一個實施方案中，緩沖劑是與原核細胞外膜相互作用的物質。在一個實施方案中，緩沖劑是一價有機胺。在一個實施方案中，緩沖劑是三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)或其鹽。在一個實施方案中，緩沖劑選自磷酸或其鹽、嗎啉或其鹽(MOPS)、3-{[三(羥甲基)甲基]氨基}丙磺酸(TAPS)、N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、3-[N-三(羥甲基)甲基氨基]-2-羥基丙磺酸(TAPSO)、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2-{[三(羥甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)、組氨酸或其鹽、甘氨酸或其鹽，或三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)或其鹽。在一個實施方案中，鹽是Tris-HCl。在一個實施方案中，Tris-HCl的濃度為約10mM至約95mM。在一個實施方案中，Tris-HCl的濃度為約15mM至約50mM。在一個實施方案中，Tris-HCl的濃度為約20mM至約60mM。在一個實施例中，本專利技術所報道的方法的特征在于：Tris-HCl的濃度為約20mM。在一個實施方案中，本專利技術所報道的方法的特征在于：本文檔來自技高網...

【技術保護點】
用于產生多肽的方法，所述方法包括?在約25℃下，在溶液中孵育(重懸)原核細胞約15分鐘至約6小時，所述溶液包含約10mM至約95mM?Tris?HCl和約2mM至約6mM?EDTA，所述溶液的pH值約7至約10，其中所述溶液基本上不含肽聚糖水解酶和糖。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2012.09.17 EP 12184738.81.用于產生多肽的方法，所述方法包括-在20-33℃下，在溶液中孵育原核細胞15分鐘至6小時，所述溶液包含10mM至95mMTris和2mM至6mMEDTA，所述溶液的pH值7至10，其中所述溶液基本上不含肽聚糖水解酶和糖；-分離所述多肽。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述pH值為8。3.根據權利要求1的方法，其特征在于所述孵育時間為30分鐘。4...

【專利技術屬性】
技術研發人員：C·尚茨，
申請(專利權)人：弗·哈夫曼拉羅切有限公司，
類型：發明
國別省市：瑞士;CH