細胞培養(yǎng)制造技術(shù)

本公開內(nèi)容涉及包含一個或更多個功能化表面的三維[3-D]細胞培養(yǎng)膜的制造，所述功能化表面適于提供適用于分析細胞之增殖、分化或功能的細胞培養(yǎng)條件，所述細胞通常為真核細胞或原核細胞。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】細胞培養(yǎng)介紹本公開內(nèi)容涉及包含一個或更多個功能化表面的三維[3-D]細胞培養(yǎng)膜的制造，所述功能化表面適于提供適用于分析細胞之增殖、分化或功能的細胞培養(yǎng)條件，所述細胞通常為真核細胞或原核細胞。所述細胞培養(yǎng)膜適用于在現(xiàn)有細胞培養(yǎng)塑料器皿中安裝并使用以用于培養(yǎng)細胞，并且還適用于高分辨率顯微技術(shù)。細胞培養(yǎng)膜的多細胞陣列形式還提供了高效且成本有效的裝置來可重復地提供培養(yǎng)物中的細胞，其可用于藥物篩選方法。
技術(shù)介紹
真核細胞(例如哺乳動物細胞)的培養(yǎng)已成為一種常規(guī)方法并且明確限定了使細胞能夠增殖、分化和發(fā)揮功能的細胞培養(yǎng)條件。通常，哺乳動物細胞的細胞培養(yǎng)需要通常由塑料(典型為聚苯乙烯)制造的無菌容器，限定生長培養(yǎng)基以及在一些實例中的飼養(yǎng)細胞和血清。飼養(yǎng)細胞的作用在于提供刺激細胞增殖和/或維持細胞處于未分化狀態(tài)并且可影響細胞功能的信號。哺乳動物細胞的培養(yǎng)具有多種應(yīng)用并且存在使用細胞培養(yǎng)來進行實驗和研究的多種體外測定和模型；例如細胞在組織工程中的用途；哺乳動物表達系統(tǒng)用于產(chǎn)生重組蛋白的用途以及哺乳動物細胞在初步藥物篩選中的用途。在初步藥物篩選中使用哺乳動物細胞以確定先導治療劑(leadtherapeutic)(例如，小分子激動劑或拮抗劑、單克隆抗體、肽治療劑、核酸適配體、小抑制性RNA)是否具有效力，然后進行動物試驗。需要提供改進的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，可在所述改進的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)哺乳動物細胞以提供技術(shù)上盡可能接近其天然狀態(tài)的細胞群體，從而能夠以可靠的方式分析細胞增殖、分化和功能。細胞培養(yǎng)系統(tǒng)在本領(lǐng)域是已知的并且技術(shù)人員已使用多年。例如，WO2010/005995公開了作為傳染病分析平臺的微圖案(micro-patterned)共培養(yǎng)系統(tǒng)。WO2003/014334公開了體外細胞培養(yǎng)方法，其提供了使得前列腺上皮細胞能夠形成與在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的前列腺腺泡非常類似的3D前列腺樣腺泡的培養(yǎng)方案。此外，WO00/34454中描述了包含微孔(microcellular)聚合物材料的細胞培養(yǎng)基材(substrate)。這些聚合物形成孔彼此相互連接的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而提供細胞可附著至其并增殖的基材。細胞培養(yǎng)通常包括使細胞在封閉的細胞培養(yǎng)容器中于無菌條件下在單層培養(yǎng)物中生長。一種方法是使用2D蛋白質(zhì)圖案或3D微孔(micro-well)。2D蛋白質(zhì)圖案已成功并廣泛地用于控制細胞行為。此外，使用硅蝕刻Si晶片[1、2]、玻璃[3]、聚二甲基硅氧烷[PDMS][4]、彈性印章(elastomericstamp)[5]、水凝膠(如瓊脂糖或PEG)[6、7]、膠原蛋白[8]或Parylen膜[9]和纖維[10]進行的微孔制造已被用于在受限環(huán)境中培養(yǎng)單細胞或有限數(shù)目的細胞。然而，該技術(shù)通常相當于使用微孔作為小型化培養(yǎng)皿而沒有利用細胞在孔中的限制以及產(chǎn)生3D蛋白質(zhì)涂覆的凹穴(nich)的可能性。這主要是因為這樣的事實：至少對單細胞培養(yǎng)而言，化學涂層在孔的側(cè)面、頂部和底部不可能不同，并因此僅可為細胞提供單一化學信號，很少觀察到優(yōu)于2D圖案化表面的優(yōu)點。此外，單細胞微孔技術(shù)不太適合于高分辨率成像，原因是其經(jīng)受由細胞和用于形成微孔的材料之間的率變化(例如硅聚合物的折射率為約1.45)所造成的圖像失真[11]。例如而非限制性地，使用原代肝細胞來舉例說明本公開內(nèi)容。我們的3D差異性表面涂層允許培養(yǎng)原代肝細胞作為具有可用于藥物代謝分析的受控膽小管[BC]形態(tài)的細胞雙聯(lián)體(doublet)。我們的技術(shù)使得功能原代肝細胞能夠在雙聯(lián)體水平培養(yǎng)至少96小時。此外，我們的技術(shù)提供可包括在任意標準細胞培養(yǎng)裝置中的通用獨立膜。本文公開的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)可用于哺乳動物細胞以提供用于產(chǎn)生更接近地反映體內(nèi)條件的細胞培養(yǎng)物的設(shè)備，從而提供應(yīng)用于例如組織工程、重組蛋白生產(chǎn)和藥物篩選的更可靠的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。專利技術(shù)陳述根據(jù)本專利技術(shù)的一個方面，提供了三維細胞培養(yǎng)基材，其包含：包含適于細胞培養(yǎng)之經(jīng)固化聚合物的穿孔膜，其特征在于所述膜具有至少兩個經(jīng)改性細胞培養(yǎng)表面，其中第一表面包含至少一種細胞培養(yǎng)劑并且第二表面包含第二種不同的細胞培養(yǎng)劑，其中所述膜增強與所述膜相締合之細胞的增殖和/或分化或功能。在本專利技術(shù)的一個優(yōu)選實施方案中，所述膜包含多個穿孔，其中所述穿孔的直徑為至少5μm至1000μm；優(yōu)選直徑為約20μm至300μm。縱橫比(aspectratio)通常被認為是外形(feature)的高度與特征性橫向尺寸之間的比例關(guān)系。在本公開內(nèi)容的上下文中，關(guān)于穿孔尺寸，縱橫比通常不大于2。在本專利技術(shù)的一個優(yōu)選實施方案中，所述穿孔的高度為10μm至50μm；優(yōu)選高度為40μm。在本專利技術(shù)的一個優(yōu)選實施方案中，所述可固化聚合物是可UV固化的。優(yōu)選地，所述可固化聚合物是基于丙烯酸的聚合物。基于丙烯酸的聚合物在本領(lǐng)域是公知的并且包括例如聚(甲基丙烯酸甲酯)[PMMA]——Norland粘合劑系列的光學粘合劑[NOA系列；參見http：//www.norlandprod.com)。另一些實例包括具有期望光學性能的可固化聚合物，其可獲自MyPolymerhttp：//www.mypolymers.com，例如折射率不同的My132、133、136、145、147。在本專利技術(shù)的一個優(yōu)選實施方案中，所述細胞培養(yǎng)劑和/或所述膜通過包含交聯(lián)劑而進行進一步改性，所述交聯(lián)劑有助于所述細胞培養(yǎng)劑與所述膜交聯(lián)，從而提供經(jīng)改性細胞培養(yǎng)表面。提供經(jīng)改性細胞培養(yǎng)表面將有助于施加至膜之細胞的生長和分化。根據(jù)本專利技術(shù)的細胞培養(yǎng)劑通常是蛋白質(zhì)或糖蛋白。涉及維持細胞之增殖和/或分化的蛋白質(zhì)是公知的。例如，典型的蛋白質(zhì)因子包括細胞外基質(zhì)蛋白，例如纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原蛋白、鈣粘附蛋白和成纖維細胞生長因子，并且(根據(jù)細胞類型)維持細胞增殖和/或分化所需的單核因子和細胞因子也包括在本專利技術(shù)的范圍內(nèi)。此外，公知的是，碳水化合物劑(例如凝集素)參與促進細胞分化并在類似和不同細胞類型之間形成細胞與細胞的接觸。在本專利技術(shù)的一個優(yōu)選實施方案中，所述膜的折射率為約1.30至約1.50；優(yōu)選約1.33至約1.45。在本專利技術(shù)的一個優(yōu)選實施方案中，所述細胞基材包含相互連接的細胞培養(yǎng)微孔的網(wǎng)絡(luò)。在本專利技術(shù)的另一個優(yōu)選實施方案中，所述網(wǎng)絡(luò)含多個長形的細胞培養(yǎng)微孔，其適于提供至少所述第一經(jīng)改性細胞培養(yǎng)表面和第二經(jīng)改性細胞培養(yǎng)表面。優(yōu)選地，所述長形微孔的長度為至少300μm。優(yōu)選地，所述長形微孔為至少30μm寬。根據(jù)本專利技術(shù)的另一個方面，提供了用于微制造包含至少一個細胞培養(yǎng)微孔的細胞培養(yǎng)膜的方法，其中所述微孔調(diào)整為有至少兩個功能化細胞培養(yǎng)表面，所述方法包括以下步驟：i)使支持物的表面與通過提供一個或更多個凸起的突出部分進行調(diào)整的基材相接觸，其中所述突出部分中的一個或更多個接觸所述支持物的表面；ii)將細胞培養(yǎng)兼容性聚合物溶液施加于所述基材，其中所述聚合物是可固化的；iii)固化所施加的聚合物以形成細胞培養(yǎng)膜；iv)從所述基材中移除所述膜并使第一膜表面與一種或更多種細胞培養(yǎng)劑相接觸；v)重新定向所述膜以暴露第二膜表面；并且使所述第二膜表面與第二種不同的細胞培養(yǎng)劑相接觸；以及任選地vi)重復iv)和/或v)以進一步功能化所述細胞培養(yǎng)膜。根據(jù)本專利技術(shù)的基材可以是硅基的，例如聚二甲基硅氧烷[PDMS]本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種三維細胞培養(yǎng)基材，其包含：包含適于細胞培養(yǎng)的固化聚合物的穿孔膜，其特征在于所述膜具有至少兩個經(jīng)改性細胞培養(yǎng)表面，其中第一表面包含至少一種細胞培養(yǎng)劑并且第二表面包含第二種不同的細胞培養(yǎng)劑，其中所述膜增強與所述膜締合之細胞的增殖和/或分化或功能。

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2012.08.01 GB 1213654.51.一種三維細胞培養(yǎng)基材，其包含：包含適于細胞培養(yǎng)的固化聚合物的穿孔膜，其特征在于所述膜具有至少兩個經(jīng)改性細胞培養(yǎng)表面，其中第一表面包含至少一種細胞培養(yǎng)劑并且第二表面包含第二種不同的細胞培養(yǎng)劑，其中所述膜增強與所述膜締合之細胞的增殖和/或分化或功能。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基材，其中所述膜包含多個穿孔，其中所述穿孔的直徑為至少5μm至1000μm。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基材，其中所述穿孔的縱橫比不大于2。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基材，其中固化聚合物是可UV固化的。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基材，其中所述可UV固化的聚合物是基于丙烯酸的聚合物。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基材，其中所述細胞培養(yǎng)劑和/或所述膜通過包含交聯(lián)劑而進行進一步改性，所述交聯(lián)劑有助于所述細胞培養(yǎng)劑與所述膜交聯(lián)，從而提供經(jīng)改性的細胞培養(yǎng)表面。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基材，其中所述膜的折射率為約1.30至約1.50。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基材，其中所述細胞培養(yǎng)基材包含相互連接之細胞培養(yǎng)微孔的網(wǎng)絡(luò)。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基材，其中所述網(wǎng)絡(luò)包含多個長形的細胞培養(yǎng)微孔，其適于提供至少所述兩個經(jīng)改性細胞培養(yǎng)表面。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的基材，其中所述長形的細胞培養(yǎng)微孔的長度為至少300μm。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的基材，其中所述長形微孔為至少30μm寬。12.一種用于微制造包含至少一個細胞培養(yǎng)微孔的細胞培養(yǎng)膜的方法，其中所述微孔調(diào)整為具有至少兩個功能化細胞培養(yǎng)表面，所述方法包括以下步驟：i)使支持物的表面與通過設(shè)置一個或更多個凸起的突出部分進行調(diào)整的基材相接觸，其中所述突出部分中的一個或更多個接觸所述支持物的表面；ii)將細胞培養(yǎng)兼容性聚合物溶液施加于所述基材，其中所述聚合物是可固化的；iii)固化所施加的聚合物以形成細胞培養(yǎng)膜；iv)從所述基材移出所述膜并使第一膜表面與一種或更多種細胞培養(yǎng)劑相接觸；v)重新定向所述膜以暴露第二膜表面；并且使所述第二膜表面與第二種不同的細胞培養(yǎng)劑相接觸；以及任選地vi)重復iv)和/或v)以進一步功能化所述細胞培養(yǎng)膜。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中步驟ii)至vi)通過包含化學交聯(lián)劑來進一步改性，所述化學交聯(lián)劑有助于所述細胞培養(yǎng)劑與所述細胞培養(yǎng)膜交聯(lián)。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述化學交聯(lián)劑是異雙功能交聯(lián)劑。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述交聯(lián)劑是α-丙烯酰基-ω-羧基琥珀酰亞胺酯聚(乙二醇)并且包括在權(quán)利要求12的步驟ii)中。16.根據(jù)權(quán)利要求12至15中任一項所述的方法，其中所述細胞培養(yǎng)劑是蛋白質(zhì)。17.根據(jù)權(quán)利要求12至15中任一項所述的方法，其中所述細胞培養(yǎng)劑是碳水化合物。18.根據(jù)權(quán)利要求12至15中任一項所述的方法，其中所述細胞培養(yǎng)劑是脂質(zhì)。19.根據(jù)權(quán)利要求12至15中任一項所述的方法，其中細胞培養(yǎng)劑包含聚氨基酸涂層。20.根據(jù)權(quán)利要求12至15中任一項所述的方法，其中所述細胞培養(yǎng)劑是防污劑。21.一種細胞培養(yǎng)膜，其通過根據(jù)權(quán)利要求12至20中任一項所述的方法獲得或能夠通過其獲得。22.一種細胞培養(yǎng)容器，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：維爾日勒·尼古拉斯·羅伯特·維亞諾夫，李秋實，
申請(專利權(quán))人：新加坡國立大學，國家科學研究中心，
類型：發(fā)明
國別省市：新加坡;SG