用于鑒別甘薯染色體的兩個(gè)DNA重復(fù)序列及FISH鑒別方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了用于鑒別甘薯染色體的兩個(gè)DNA重復(fù)序列及FISH鑒別方法，屬于細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。所述序列是SEQ?NO：1所示的核苷酸序列Itf_1和SEQ?NO：2所示的核苷酸序列Itf_2。所述方法為提取質(zhì)粒DNA后，通過(guò)缺刻平移法，用生物素標(biāo)記的Itf_1和用地高辛標(biāo)記的Itf_2，形成Itf_1和Itf_2探針，經(jīng)過(guò)染色體片的制備、熒光原位雜交、信號(hào)檢測(cè)等步驟，有效地解決了甘薯因染色體較小，數(shù)目較多，細(xì)胞質(zhì)濃厚和染色能力弱等問題而不能通過(guò)傳統(tǒng)的方式進(jìn)行分辨識(shí)別的難題，探針的熒光信號(hào)強(qiáng)，易于檢測(cè)，且重復(fù)性高，能直觀、簡(jiǎn)便、快速、有效地鑒別甘薯染色體。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)
，具體涉及鑒別甘薯染色體的兩個(gè)DNA重復(fù)序列及FISH鑒別方法。
技術(shù)介紹
甘薯是旋花科甘薯屬植物，富含淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素、β-胡蘿卜素和多種維生素，被世界衛(wèi)生組織列為13種最佳蔬菜的冠軍。在亞、非、拉美等熱帶及亞熱帶地區(qū)廣為栽培，是一種重要的糧食、蔬菜、工業(yè)原料作物及新型能源作物。近年來(lái)，甘薯在能源、健康食品、飼料等方面的價(jià)值越來(lái)越受到人們的重視，已經(jīng)培育出了很多新型優(yōu)良品種。甘薯屬植物染色體的基礎(chǔ)研究薄弱，相對(duì)滯后于水稻、小麥等其他作物。甘薯屬植物染色體有2×、4×、6×三種倍性，栽培種基本為6×。其染色體較小，數(shù)目較多，細(xì)胞質(zhì)濃厚和染色能力弱，較難獲得清晰干凈的染色體制片，難以從細(xì)胞遺傳學(xué)水平進(jìn)行研究。目前的研究主要集中在染色體數(shù)目與減數(shù)分裂行為的觀察，對(duì)甘薯多倍體的染色體組成和結(jié)構(gòu)研究甚少。顯帶技術(shù)和原位雜交技術(shù)(ISH)是研究染色體組成和結(jié)構(gòu)比較重要的兩種技術(shù)。顯帶技術(shù)主要是通過(guò)不同染色體的常異染色質(zhì)的位置區(qū)分。原位雜交技術(shù)主要有基因組原位雜交技術(shù)(GISH)和熒光原位雜交技術(shù)(FISH)，GISH主要是利用物種之間DNA同源性的差異，用另一物種的基因組DNA以適當(dāng)?shù)臐舛茸鞣庾瑁诎腥旧w上進(jìn)行原位雜交。FISH是根據(jù)已知微生物不同分類級(jí)別上種群特異的DNA序列，以利用熒光標(biāo)記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與環(huán)境基因組中DNA分子雜交，通過(guò)熒光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào)DNA序列在染色體或DNA顯微切片上的目的DNA序列，進(jìn)而確定其雜交位點(diǎn)。上述現(xiàn)有技術(shù)均可以有效區(qū)分染色體較大、較少或區(qū)分度比較明顯的物種的不同對(duì)染色體，但對(duì)于染色體較小，且數(shù)目多，形態(tài)相近的甘薯物種，通過(guò)常規(guī)的顯帶、原位雜交等技術(shù)仍然不能很好的識(shí)別不同對(duì)染色體。同樣，GISH的方法對(duì)于遺傳背景十分復(fù)雜的甘薯物種也不能起到很好的識(shí)別效果。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供鑒別甘薯染色體的兩個(gè)DNA重復(fù)序列。?本專利技術(shù)的另一目的是提供一種以上述兩個(gè)DNA重復(fù)序列為探針的熒光原位?雜交方法，直觀、簡(jiǎn)便、快速、有效地鑒別甘薯染色體。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案：鑒別甘薯染色體的DNA重復(fù)序列，序列Itf_1具有SEQ?NO：1所示的核苷酸序列，Itf_2具有SEQ?NO：2所示的核苷酸序列。一種利用上述DNA重復(fù)序列鑒別甘薯染色體的熒光原位雜交方法，質(zhì)粒DNA提取后，通過(guò)缺刻平移法，用生物素標(biāo)記的Itf_1和用地高辛標(biāo)記的Itf_2，形成Itf_1和Itf_2探針，用于對(duì)甘薯染色體的鑒別，具體步驟包括：1)染色體片的制備按常規(guī)植物材料培養(yǎng)，待植株根尖長(zhǎng)至0.5-1cm時(shí)，切下生長(zhǎng)旺盛的根尖，經(jīng)8-羥基喹啉在25℃下處理2h后，用卡諾氏固定液固定24h；去離子水沖洗浸泡30min，充分洗去固定液；用含2％纖維素酶和1％果膠酶的纖維素果膠酶在37℃酶解1-2h；去離子水沖洗浸泡30min，充分洗去酶液；取1-2根尖于干凈玻片上，用鑷子尖端敲碎根尖，懸空滴加卡諾氏固定液使其充分散開，酒精燈上烤一下，晾干；鏡檢，選擇分散良好的染色體片-20℃保存；2)熒光原位雜交?①烤片：雜交之前，將制好的片子置于65℃烘箱中干燥30-60min；②雜交液的配制：取ssDNA4μL和Itf_1，Itf_2探針DNA各3μL，混勻后于65℃烘箱中烘至4μL，再加入70％去離子甲酰胺10μL、50％硫酸葡聚糖4μL、20×SSC?2μL混勻，封口膜封好備用；③變性液的配制：取雙蒸水20μL、20×SSC10μL、70％去離子甲酰胺70μL，混勻，封口膜封好備用；④探針變性：取出烘箱中的染色體片，將烘箱升溫至85℃，將上述變性液加于取出的載玻片上，加上蓋玻片；85℃烘箱中變性2-4min；甩掉蓋玻片，立即依次浸入-20℃70％、95％、100％的冰乙醇中各5min；取出玻片，空氣中干燥30min以上；⑤雜交：將雜交液放入沸水中變性10min，迅速置于冰上冷卻10min，加于上一步干燥后的載玻片上，蓋上蓋玻片，室溫5-10min；置于80-85℃烘箱中變性2min，放入培養(yǎng)皿中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)17-21h；⑥雜交后洗脫：取出培養(yǎng)箱中的玻片，置于2×SSC中脫色搖床上室溫洗脫2×5min；置于42℃2×SSC中洗脫10min；2×SSC中脫色搖床上再次洗脫5min；?1×TNT中脫色搖床上洗脫5min，晾干；剪取和玻片大小吻合的封口膜，取出TNB室溫融化；避光條件下，取一個(gè)1.5μL的EP管，加入100μL?TNB，1μL?Bio，0.5μLDig抗體，混勻，取100μL加于晾干的玻片上，蓋上封口膜，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h；取出玻片，置于1×TNT中脫色搖床上洗脫3×5min；晾干玻片5-10min；3)信號(hào)檢測(cè)加13μL?DAPI，蓋上蓋玻片，晾干，封片，置于熒光顯微鏡下，根據(jù)制片坐標(biāo)確定目標(biāo)染色體，對(duì)染色體進(jìn)行拍照，然后依次轉(zhuǎn)換濾光片，分別對(duì)兩個(gè)探針的雜交信號(hào)進(jìn)行拍照；4)二次雜交①洗片：揭掉第一次雜交的蓋玻片，將載玻片置于2×SSC溶液中脫色搖床上洗脫2×5min；置于2×SSC溶液中脫色搖床上再次洗脫2×10min；然后依次浸入70％、95％、100％的乙醇中脫色搖床上室溫洗脫各5min；置于卡諾氏固定液中固定5min，取出玻片，晾干，充分曝光2-3天；②熒光原位雜交：用45S，5S?rDNA探針進(jìn)行第二次熒光原位雜交，雜交過(guò)程同步驟2，再分別對(duì)兩個(gè)探針的雜交信號(hào)進(jìn)行拍照；采用成像系統(tǒng)分析軟件將染色體和雜交信號(hào)進(jìn)行圖像合成，用圖像處理軟件對(duì)圖像進(jìn)行調(diào)整。所述Itf_1探針是這樣獲得的：根據(jù)SEQ?NO：1所示的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增待測(cè)模板，所述引物為，上游引物：5’-TTCCCGATGCGTGGAGTT-3’，下游引物：5’-CTCCATTGCGGTTGTCTTA-3’，采用PCR法合成生物素標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ?NO：1所示的探針，得到Itf_1探針；所述Itf_2探針是這樣獲得的：根據(jù)SEQ?NO：2所示的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增待測(cè)模板，所述引物為，上游引物：5’-CCCCACCTTCAACCAACT-3’，下游引物：5’-GCAGCGGTTAGGAGGTGA-3’，采用PCR法合成地高辛標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ?NO：2所示的探針，得到Itf_2探針。優(yōu)選的，所述卡諾氏固定液是由3份無(wú)水乙醇和1份冰醋酸配制而成。優(yōu)選的，所述熒光原位雜交步驟④中，探針在85℃烘箱中變性3min。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有以下特點(diǎn)：本專利技術(shù)利用兩個(gè)DNA重復(fù)序列進(jìn)行熒光原位雜交，探針的熒光信號(hào)強(qiáng)，易于檢測(cè)，且重復(fù)性高，有效地解決了甘薯因染色體較小，數(shù)目較多，細(xì)胞質(zhì)濃厚和染色能力弱等問題而不能通過(guò)傳統(tǒng)的方式進(jìn)行分辨識(shí)別的難題；加上45S?rDNA和5S?rDNA探針，總共只需要4個(gè)探針，兩次雜交即可有效排列甘薯核型的效果，為甘薯染色體鑒定和結(jié)構(gòu)研究、甘薯本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
鑒別甘薯染色體的兩個(gè)DNA重復(fù)序列，其特征在于，序列1具有SEQ?NO：1所示的核苷酸序列，序列2具有SEQ?NO：2所示的核苷酸序列。

【技術(shù)特征摘要】
1.鑒別甘薯染色體的兩個(gè)DNA重復(fù)序列，其特征在于，序列1具有SEQ?NO：
1所示的核苷酸序列，序列2具有SEQ?NO：2所示的核苷酸序列。
2.一種利用權(quán)利要求1所述DNA重復(fù)序列鑒別甘薯染色體的熒光原位雜
交方法，其特征在于，質(zhì)粒DNA提取后，通過(guò)缺刻平移法，用生物素標(biāo)記的Itf_1
和用地高辛標(biāo)記的Itf_2，形成Itf_1和Itf_2探針，用于對(duì)甘薯染色體的鑒別，具
體步驟包括：
1)染色體片的制備
按常規(guī)植物材料培養(yǎng)，待植株根尖長(zhǎng)至0.5-1cm時(shí)，切下生長(zhǎng)旺盛的根尖，
經(jīng)8-羥基喹啉在25℃下處理2h后，用卡諾氏固定液固定24h；去離子水沖洗浸
泡30min，充分洗去固定液；用含2％纖維素酶和1％果膠酶的纖維素果膠酶在
37℃酶解1-2h；去離子水沖洗浸泡30min，充分洗去酶液；取1-2根尖于干凈玻
片上，用鑷子尖端敲碎根尖，懸空滴加卡諾氏固定液使其充分散開，酒精燈上烤
一下，晾干；鏡檢，選擇分散良好的染色體片-20℃保存；
2)熒光原位雜交
①烤片：雜交之前，將制好的片子置于65℃烘箱中干燥30-60min；
②雜交液的配制：取ssDNA4μL和Itf_1，Itf_2探針DNA各3μL，混勻后
于65℃烘箱中烘至4μL，再加入70％去離子甲酰胺10μL、50％硫酸葡聚糖4μL、
20×SSC?2μL混勻，封口膜封好備用；
③變性液的配制：取雙蒸水20μL、20×SSC10μL、70％去離子甲酰胺70μL，
混勻，封口膜封好備用；
④探針變性：取出烘箱中的染色體片，將烘箱升溫至85℃，將上述變性液
加于取出的載玻片上，加上蓋玻片；85℃烘箱中變性2-4min；甩掉蓋玻片，立
即依次浸入-20℃70％、95％、100％的冰乙醇中各5min；取出玻片，空氣中干
燥30min以上；
⑤雜交：將雜交液放入沸水中變性10min，迅速置于冰上冷卻10min，加于
上一步干燥后的載玻片上，蓋上蓋玻片，室溫5-10min；置于80-85℃烘箱中變
性2min，放入培養(yǎng)皿中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)17-21h；
⑥雜交后洗脫：取出培養(yǎng)箱中的玻片，置于2×SSC中脫色搖床上室溫洗脫
2×5min；置于42℃2×SSC中洗脫10min；2×SSC中脫色搖床上再次洗脫5min；

\t1×TNT中脫色搖床上洗脫5min，晾干；剪取和玻片大小...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李宗蕓，俞立璇，韓永華，陳孚堯，孫健英，董婷婷，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：江蘇師范大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：江蘇;32