一種高通量的連續性核酸擴增檢測聯用裝置及方法制造方法及圖紙

本發明專利技術提供了一種高通量的連續性核酸擴增檢測聯用裝置及方法。其擴增與檢測方法如下：使PCR反應物料沿毛細管流動，通過毛細管外部設置的多個溫控區域對反應物料的溫度進行調節，使PCR反應物料依次經過變性、退火、延伸過程，完成PCR擴增反應。由收集模塊對擴大后的樣本進行分批收集并且置于待檢測區域；檢測模塊對收集的樣品進行分析，主要的過程如下：待分析的生物樣品通過電泳方式進入毛細管整列并且按照分子量或者體積的大小在毛細管中排列，通過檢測模塊對毛細管進行掃描并且記錄結果，生物樣品可以通過標記熒光物質或者對特定波長的光的吸收被檢測模塊感知，檢測完畢后樣品載體分批存放。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術提供了一種PCR擴增反應及檢測用的裝置，屬于生化設備

技術介紹
DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入設計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。PCR (聚合酶鏈式反應)是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫(經常是60°C左右)時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度(72°C左右)，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5' -3')的方向合成互補鏈。基于聚合酶制造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。自perkin-elmercetus公司第一臺per擴增儀問世以來，現已有幾十家不同的廠家在國內外生產和銷售per擴增儀。在短短的幾年間，擴增儀經過幾代的發展，不斷采用新技術，并且進一步朝方便、實用、高智能化和自動化的方向發展。PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性一退火一延伸三個基本反應步驟構成:①模板DNA的變性:模板DNA經加熱至93°C左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55°C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸:DNA模板一引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環變性一退火一延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2?4分鐘，2?3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。毛細管電泳(capillary electrophoresis，CE)又叫高效毛細管電泳(HPCE)，是近年來發展最快的分析方法之一。1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75 μ m內徑毛細管柱內用高電壓進行分離，創立了現代毛細管電泳。1984年Terabe等建立了膠束毛細管電動力學色譜。1987年Hjerten建立了毛細管等電聚焦，Cohen和Karger提出了毛細管凝膠電泳。1988?1989年出現了第一批毛細管電泳商品儀器。短短幾年內，由于CE符合了以生物工程為代表的生命科學各領域中對多肽、蛋白質(包括酶，抗體)、核苷酸乃至脫氧核糖核酸(DNA)的分離分析要求，得到了迅速的發展。目前PCR技術雖然的到了很大的發展，但是所有的PCR反應都必須在PCR反應管中實現，這樣，單獨的PCR反應的體系就不能超過200微升，這就限制了特定基因的大量制備；同時，目前的PCR儀器擴大擴增的通量主要依靠增大反應的孔的數目，目前高通量的PCR儀器已經做到了 384孔，可以同時擴增或者定量384個樣品，但是面對上千或者上萬的樣品的擴增和檢測，就比較困難了 ；傳統PCR反應時間通常為2小時以上，這其中大部分的時間被用在溫度的變化上。同時毛細管檢測技術(CE)實現了高通量檢測，并且實現了自動化的操作，但是，在與大規模的核酸制備檢測聯用方面并沒有先例。
技術實現思路
本專利技術的目的是解決現有技術當中PCR擴增操作步驟繁瑣、擴增量受到限制、無法連續操作的問題，提供了一種具有高通量的連續性PCR擴增方法，并且與毛細管檢測技術聯用，實現了樣本的高通量制備并且檢測，采用了如下的技術方案:一種高通量的連續性核酸擴增檢測方法，包括如下步驟:使PCR反應物料沿毛細管流動，通過毛細管外部設置的多個溫控區域對反應物料的溫度進行調節，使PCR反應物料依次經過變性、退火、延伸過程，完成PCR擴增反應，擴增反應的產物通過收集進入收集器，進而進行之后的毛細管分析檢測。分析數據被收集，可以對樣本進行數據的分析。該技術方案基于如下原理:PCR擴增一般是分為三個過程，變性、退火、延伸，每個過程所需要的溫度和時間都不相同，當PCR反應物料沿著毛細管流動時，會依次由多個溫控區域對其進行變溫，因此將這些溫控區域分別設置為所需要的變性、退火、延伸溫度時，即能實現物料的PCR反應；另外，由于反應物料是沿著毛細管中流動的，所以物料會依次進入到變性、退火、延伸區域，當完成這一段流動時，就完成了一個反應循環，如果多次通過變性、退火、延伸溫控區域時，就完成了多個PCR反應循環，當物料流出毛細管時，即得到了反應完成的物料。同時，毛細管電泳所用的石英毛細管柱，在一定的pH值情況下，其內表面帶負電，與緩沖液接觸時形成雙電層，在高壓電場作用下，形成雙電層一側的緩沖液由于帶正電而向負極方向移動，從而形成電滲流。同時，在緩沖溶液中，帶電粒子在電場作用下，以各自不同速度向其所帶電荷極性相反方向移動，形成電泳。帶電粒子在毛細管緩沖液中的迀移速度等于電泳和電滲流的矢量和。各種粒子由于所帶電荷多少、質量、體積以及形狀不同等因素引起迀移速度不同而實現分離。作為對上述方法的改進，溫控區域的長度是可調節的。對于不同的PCR反應，其變性、退火、延伸所需的時間是不同的，如果溫控區域的長度可調，則可以調節反應物料在溫控區域內的停留時間，以此來實現反應時間的改變。作為對上述方法的改進，溫控區域之間依次排布并首尾相連構成閉合結構，毛細管是沿著閉合的溫控結構纏繞。采用這樣的結構時，就可以避免使用較多的溫控裝置，毛細管在溫控區域組成的閉合結構上可以多次經過，即相當于多次進行了 PCR擴增循環，而且在實際使用時，循環次數也較容易控制，將毛細管繞不同圈數的時候，就可以實現不同的循環次數。在使用時，毛細管的入口是設置于執行變性反應溫度的溫控區域上，毛細管的出口是設置于執行延伸反的溫控區域上，此時，毛細管中的反應物剛被溫控區域進行溫度調整時，即進行了變性反應，最后當完成了最后一個循環的延伸反應后，離開毛細管。作為對上述方法的改進，溫控區域共有3個。將這3個溫控區域首尾連接，每個區域分別屬于變性、退火、延伸段，成一個閉合環時，毛細管每繞一圈，就是相當于一個PCR循環。作為對上述方法的改進，在毛細管的入口處間隔加入反應物和隔離流體；所述的隔離流體是指與反應物不混溶的氣體或者液體。通過這樣的改進手段，可以利用隔離流體將反應物分隔為許多個小段，那么就可以實現不同的反應體系的同時擴增，例如:如果要對不同的DNA樣本進行擴增時，可以將這些DNA樣本加入到同一種反應液中，然后用隔離流體將這些反應體系分隔開，那么就實現了同時擴增不同來源的DNA樣本；如果想要考察不同反應液對于擴增反應的影響時，可以配制不同的反應液，然后加入相同的DNA樣本，就可以實現這些對于不同反應液的擴增性能的考察。隔離流體一般情況下，可以選用空氣、惰性氣體(氮氣、氦氣等)，也可以是與反應液不相溶的液體等。作為對上述方法的改進，將毛細管的檢測單元與之前的制備單元結合起來，實現高通量制備檢測本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種高通量的連續性核酸擴增方法，包括如下步驟：使PCR反應物料沿毛細管流動，通過毛細管外部設置的多個溫控區域對反應物料的溫度進行調節，使PCR反應物料依次經過變性、退火、延伸過程，完成PCR擴增反應。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：楊錦宇，王銀珠，管雷，
申請(專利權)人：河海大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32