一種從錳結核中篩選硅酸鹽細菌的方法技術

本發明專利技術提供了一種從錳結核中快速篩選硅酸鹽細菌的方法，包括如下步驟：稱取錳結核樣，將其加入至滅菌蒸餾水中，并分散均勻，得到濃度為0.05-0.2g/mL的懸濁液；將得到的懸濁液逐級稀釋并涂板，并于恒溫培養箱中倒置培養；在得到的菌落中選取典型菌落于培養基上劃線繼續培養，所述典型菌落為透明或半透明、菌落半玻璃珠狀凸起、不易挑起及挑起拉絲的菌落；所述培養基為無氮固體選擇培養基；重復前述步驟的處理過程至菌落得到純化。本發明專利技術具有效率高、操作簡單和結果可靠等優點，可促進從礦物中篩選微生物的工作效率。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及微生物菌種的篩選方法，具體涉及大洋錳結核樣品中的硅酸鹽微生物菌種的篩選分離培養方法。
技術介紹
微生物，特別是大洋這種極端環境中的微生物，在自然生物、地球化學循環等方面有著極為重要的作用。研究大洋中的微生物，有助于我們了解和認識生命的起源和生命進化，以及在大洋環境中，微生物的耐受機制及其與環境的相互作用。微生物菌種資源，特別是具有特殊價值的菌種資源的爭奪已成為當今國際生物資源爭奪的一個重要組成部分。硅酸鹽細菌是指能夠分解硅酸鹽類礦物的細菌，主要包括環狀芽孢桿菌(bacillus?circulans)和膠質芽孢桿菌(bacillus?mucilaginosus)。前蘇聯亞歷山大羅夫從土壤中分離得到一株能夠分解正長石和磷灰石的細菌并將其命名為硅酸鹽細菌。硅酸鹽細菌分解礦石釋放出可溶性鉀和磷，故被作為細菌肥料使用，相關研究也較多。硅酸鹽細菌在礦石脫硅提高品位方面有較多的研究報道，主要用于鋁土礦、錳礦和鎳礦脫硅，其在浮選中的應用前景廣闊。
技術實現思路
本專利技術的目的是解決篩選硅酸鹽細菌的問題。本專利技術提供的從錳結核中篩選硅酸鹽細菌的方法，包括如下的步驟：(1)稱取錳結核樣，將其加入至滅菌蒸餾水中，并分散均勻，得到濃度為0.05-0.2g/mL的懸濁液；(2)將步驟(1)得到的懸濁液逐級稀釋并涂板，并于恒溫培養箱中倒置培養；(3)在步驟(2)得到的菌落中選取典型菌落于培養基上劃線繼續培養，所述典型菌落為透明或半透明、菌落半玻璃珠狀凸起、不易挑起及挑起拉絲的菌落；所述培養基為無氮固體選擇培養基；(4)步驟(3)得到的細菌按步驟(3)的步驟重復處理至菌落得到純化。在菌種得到純化后，可將步驟(4)中所得菌株接種至固體平板培養基，培養2d后觀察菌落形態，并進行革蘭氏染色、莢膜染色，于光學顯微鏡下觀察；或將步驟(4)中?所得菌株接種至液體培養基，培養至對數期，取樣在光學顯微鏡下觀察其運動狀態。優選的，步驟(1)分散時的溫度為25-40攝氏度。更優選的，所述步驟(1)的分散過程為錳結核樣的懸濁液于溫度30℃，150rpm震蕩1h，靜置30min，得10-1g/mL濃度試樣菌懸液優選的，步驟(2)中培養基組成包括：蔗糖5.0g/L、Na2HPO42.0g/L、MgSO4·7H2O?0.5g/L、FeCl30.005g/L、CaCO30.1g/L、高嶺土0.5g/L和瓊脂10-15g/L，并于121℃滅菌30min。優選的，步驟(2)和步驟(3)培養溫度為25-35攝氏度。優選的，步驟(2)和步驟(3)培養時間為0.5-10d。更優選的，步驟(2)培養時間為1-3d。更優選的，步驟(3)培養時間為2-5d，步驟(3)培養過程重復3-4次。優選的，步驟(3)劃線操作中采用平板劃線試驗進行操作。優選的，所述方法為：采用10倍稀釋法將細菌分離母液稀釋成10-2～10-5g/mL四種不同濃度，取各濃度細菌懸浮液均勻涂布于固體培養基平板上，將平板放置于恒溫生化培養箱中倒置培養，培養2-5d后觀察菌落生長情況，挑選典型菌落在平板上劃線培養2～5d，再挑選單個菌落重復劃線培養3～4次，直至獲得純菌種。在本專利技術的一實施例中，采用10倍稀釋法將細菌分離母液稀釋成10-2～10-5四種不同濃度，取各濃度細菌懸浮液0.2mL用無菌涂布棒均勻涂布于無氮固體選擇培養基平板上，將平板放置于30℃恒溫生化培養箱中倒置培養。每個濃度設三組重復實驗。培養72h后觀察菌落生長情況，挑選條件的硅酸鹽細菌菌落特征的菌落在平板上劃線培養2～5d，再挑選單個菌落重復劃線培養3～4次，同時檢驗其純度，直至獲得純菌種。經劃線培養得到一株典型的具有硅酸鹽細菌特征的細菌，在無氮選擇培養基上培養24h～36h就有菌落生長，菌落為光滑的圓形，邊緣整齊、透明、隆起、粘稠，菌落不易挑起，易拉絲，富有彈性，培養1～2d菌落直徑1～3mm，3～7d菌落直徑5～10mm。顯微鏡觀察菌體不運動。本專利技術具有效率高、操作簡單、所需時間較短和結果可靠等優點，可以促進從礦物中篩選微生物的工作效率。附圖說明圖1、本方法的操作流程圖。具體實施方式如下為本申請的具體實施例，其僅用于對本申請的解釋而并非限制。如下實施例中大洋錳結核樣為大洋一號27航次2013年7月在太平洋國際海底區域采用拖網方式采集得到的樣品。本專利技術實施例中的典型菌落為透明或半透明、菌落半玻璃珠狀凸起、不易挑起及挑起拉絲的菌落。如下實施例中，培養基具有如下的組成：蔗糖5.0g/L、Na2HPO42.0g/L、MgSO4·7H2O?0.5g/L、FeCl30.005g/L、CaCO30.1g/L、高嶺土0.5g/L和瓊脂10-15g/L，并于121℃滅菌30min。實施例1、參見圖1，稱取大洋錳結核樣10g，置于錐形瓶中，加入90mL滅菌蒸餾水中，并加玻璃珠，置于搖床中震蕩得試樣菌懸液。將所得試樣菌懸液逐級稀釋并涂平板，后于恒溫培養箱倒置培養。24h后觀察菌落生長狀態。挑取典型的硅酸鹽單菌落，在培養基上劃線后繼續培養。將所得細菌重復此操作4次，在顯微鏡下看到細菌形態大小基本一致。再次挑選細菌進行平板培養，送于檢測單位測試基因序列，得結果。得到的細菌的參考物種為Azotobacter?chroococcum(園褐固氮菌)，類屬Bacteria；Proteobacteria；Gammaproteobacteria；Pseudomonadales；Pseudomonadaceae；Azotobacter.同源度99％，其序列見序列表第一部分。實施例2、參見圖1，稱取大洋錳結核樣10g，置于錐形瓶中，加入90mL滅菌蒸餾水中，并加玻璃珠，置于搖床中震蕩得試樣菌懸液。將所得試樣菌懸液逐級稀釋并涂平板，后于恒溫培養箱倒置培養。24h后觀察菌落生長狀態。挑取典型的硅酸鹽單菌落，在培養基上劃線后繼續培養。將所得細菌重復此操作4次，在顯微鏡下看到細菌形態大小基本一致。再次挑選細菌進行平板培養，送與檢測單位測試基因序列，得結果。該細菌的參考物種為Azotobacter?chroococcum(圓褐固氮菌)，類屬Bacteria；Proteobacteria；Gammaproteobacteria；Pseudomonadales；Pseudomonadaceae；Azotobacter.同源度99％，其序列見序列表第二部分。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種從錳結核中篩選硅酸鹽細菌的方法,包括如下步驟：(1)稱取錳結核樣，將其加入至滅菌蒸餾水中，并分散均勻，得到濃度為0.05?0.2g/mL的懸濁液；(2)將步驟(1)得到的懸濁液逐級稀釋并涂板，并于恒溫培養箱中倒置培養；(3)在步驟(2)得到的菌落中選取典型菌落于培養基上劃線繼續培養，所述典型菌落為透明或半透明、菌落半玻璃珠狀凸起、不易挑起及挑起拉絲的菌落；所述培養基為無氮固體選擇培養基；(4)步驟(3)得到的細菌按步驟(3)的步驟重復處理至菌落得到純化。

【技術特征摘要】
1.一種從錳結核中篩選硅酸鹽細菌的方法,包括如下步驟：
(1)稱取錳結核樣，將其加入至滅菌蒸餾水中，并分散均勻，得到濃度為0.05-
0.2g/mL的懸濁液；
(2)將步驟(1)得到的懸濁液逐級稀釋并涂板，并于恒溫培養箱中倒置培養；
(3)在步驟(2)得到的菌落中選取典型菌落于培養基上劃線繼續培養，所述典型
菌落為透明或半透明、菌落半玻璃珠狀凸起、不易挑起及挑起拉絲的菌落；所述培
養基為無氮固體選擇培養基；
(4)步驟(3)得到的細菌按步驟(3)的步驟重復處理至菌落得到純化。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中培養基組成包括：蔗糖
5.0g/L、Na2HPO42.0g/L、MgSO4·7H2O?0.5g/L、FeCl30.005g/L、CaCO30.1g/L、
高嶺土0.5g/L和瓊脂10-15g/L，并于121℃滅菌3...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李浩然，滕青，
申請(專利權)人：中國科學院過程工程研究所，中國大洋礦產資源研究開發協會，
類型：發明
國別省市：北京;11