人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法，包括以下步驟：胎盤標(biāo)本處理，得處理后的胎盤組織，將胎盤組織進(jìn)行組織消化，得細(xì)胞懸液；胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的初步傳代培養(yǎng)；胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的進(jìn)一步分離與培養(yǎng)。本發(fā)明專利技術(shù)采用HyQTase和DNAse?I共同消化，分離到胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，初步培養(yǎng)后，再經(jīng)微重力及電磁場和聲波處理，以及BMP4多次處理，用差速貼壁法除掉上層，向培養(yǎng)瓶中補(bǔ)加無血清培養(yǎng)基和抗氧化劑培養(yǎng)，最終純度很高；通過對其連續(xù)傳代過程中的遺傳穩(wěn)定性、細(xì)胞表面分子表達(dá)情況、細(xì)胞形態(tài)檢測等驗(yàn)證了該細(xì)胞的干細(xì)胞特性，為胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞作為臨床應(yīng)用的種子細(xì)胞等提供了材料。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及生物醫(yī)學(xué)
，具體是涉及。
技術(shù)介紹
胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞具有采集方便、易于體外培養(yǎng)、擴(kuò)增和誘導(dǎo)等特性，被認(rèn)為是干細(xì)胞研究的一種理想種子細(xì)胞。常規(guī)分離方法通常難以獲得大量純度較高胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞；應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選法或磁珠分選法獲得的細(xì)胞雖然純度好，但成本很高。胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞在胎盤組織的豐度低，想獲得一定數(shù)量的原代細(xì)胞也需要很多的胎盤組織。現(xiàn)有技術(shù)中，胎盤的細(xì)胞成分較復(fù)雜，尤其是其中的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能以及抑制淋巴細(xì)胞增殖的特性，常規(guī)離方法通常難以獲得大量且純度較高的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種，可以達(dá)到一次操作即可獲得大量、較高純度的人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的目的。本專利技術(shù)解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案為:，其特征在于包括以下步驟:(I)胎盤標(biāo)本處理，得處理后的胎盤組織；將胎盤組織進(jìn)行組織消化，用15mmol/L三羥甲基氨基甲烷，加入哈特曼-D溶液，調(diào)節(jié)pH至8.0，作為消化緩沖液，加入終濃度為2.4g/L HyQTase和300U/mL DNase I組成的消化液，取消化液200mL，將沖洗后的胎盤組織分多次進(jìn)行消化，每次在37±0.2°C,200r/min恒溫氣浴搖床消化3min，消化完畢后，220目濾網(wǎng)過濾，收集單細(xì)胞，無菌去除HyQTase溶液，用新生牛血清終止消化反應(yīng)，得到單細(xì)胞懸液；(2)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的初步傳代培養(yǎng):將步驟(I)的單細(xì)胞懸液調(diào)整單細(xì)胞密度為I X 15個(gè)/mL，接種于25mm細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37°C ,5% CO 2濃度的CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天進(jìn)行換液，細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶底面積60 %時(shí)，加入HyQTase和300U/mL DNase I組成的消化液消化4min，加等體積新生牛血清終止消化，用D-Hank’ s液稀釋5倍后，室溫下100g離心12min，棄上清，吹打混勻；(3)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的進(jìn)一步分離與培養(yǎng):用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12、丙酮酸鹽、10毫克/升亞砸酸鈉胰島素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克/mL的bFGF、增殖促進(jìn)劑配制成懸浮液，所述增殖促進(jìn)劑為凝結(jié)的臍帶血液的液體成分，將步驟(2)獲得的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行重懸，在微重力環(huán)境下，依次通過電磁場和聲波處理間充質(zhì)干細(xì)胞，計(jì)數(shù)并接種于75mm的培養(yǎng)瓶，在培養(yǎng)基中補(bǔ)充4mg/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子、10ng/ml N-乙酰基-L-半胱氨酸、100ng/ml氯化鈣，放入37°C、二氧化碳濃度為0.5%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2d換液I次，細(xì)胞生長至90%融合后，消化并計(jì)數(shù)細(xì)胞，細(xì)胞傳代后生長速度較快，細(xì)胞形態(tài)比較均一，變化形態(tài)明顯的第2天用100ng/ml的BMP4處理，第3天或4用10ng/ml的BMP4處理，第5天用lng/ml的BMP4處理，到第6天時(shí)，用差速貼壁法將未貼壁的上層除掉，然后向培養(yǎng)瓶中補(bǔ)加無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待培養(yǎng)8?9天時(shí)細(xì)胞開始出現(xiàn)老化現(xiàn)象，此時(shí)需要注入一種抗氧化劑，所述抗氧化劑為聚乙二醇-綴合過氧化氫酶或N-乙酰半胱氨酸，或使用抗氧化物，所述抗氧化物為1-500 μ M丙酮酸乙酯(EP)，抑制間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老，用于增加干細(xì)胞產(chǎn)量，待培養(yǎng)10?13天后即可獲得人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞原代細(xì)胞。進(jìn)一步地，在上述方案中，所述的胎盤標(biāo)本處理步驟包括:無菌條件下取足月生產(chǎn)的胎盤組織，剪取小塊胎兒蛻膜側(cè)胎盤組織剪碎，浸泡于含有抗菌肽的保存液中，所述含有抗菌肽的保存液是將50微克/毫升多聚賴氨酸加入到50微克/毫升沒食子酸酯EGCG中配制而成，浸泡預(yù)定時(shí)間后，用生理鹽水反復(fù)沖洗血污，直至沖洗液接近無色。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)的有益效果是:(I)采用HyQTase和DNAse I共同消化，分離出胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，在連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中該細(xì)胞形態(tài)始終保持一致，未發(fā)現(xiàn)分化細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)；再將初步培養(yǎng)后獲得的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞用差速貼壁法將未貼壁的上層除掉，然后向培養(yǎng)瓶中補(bǔ)加無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，最終純度很高。(2)本方法成功地從胎盤組織中分離到胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，并通過對其連續(xù)傳代過程中的遺傳穩(wěn)定性，以及細(xì)胞表面分子表達(dá)情況，細(xì)胞形態(tài)檢測等驗(yàn)證了該細(xì)胞的干細(xì)胞特性，從而建立了較完善的細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定的體系，為進(jìn)一步研究胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)和免疫學(xué)特性、分化能力，以及將其作為臨床應(yīng)用的種子細(xì)胞等提供了材料。【附圖說明】圖1為本專利技術(shù)實(shí)施例中胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)鑒定圖，A:原代胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(x200)，B:第十八代胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞圖(x200):圖2為本專利技術(shù)實(shí)施例中流式細(xì)胞儀對胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表面抗原的鑒定圖，A:陰性對照，B:CD29檢測結(jié)果，C:CD44檢測結(jié)果，D:CD105檢測結(jié)果；圖3為本專利技術(shù)實(shí)施例中胎盤間充質(zhì)細(xì)胞染色體核型分析圖，A:第二代細(xì)胞染色體核型x400 ；B:第十八代細(xì)胞染色體核型x400。【具體實(shí)施方式】，其特征在于包括以下步驟:(I)胎盤標(biāo)本處理，無菌條件下取足月生產(chǎn)的胎盤組織，剪取小塊胎兒蛻膜側(cè)胎盤組織剪碎，浸泡于含有抗菌肽的保存液中，所述含有抗菌肽的保存液是將50微克/毫升多聚賴氨酸加入到50微克/毫升沒食子酸酯EGCG中配制而成，浸泡預(yù)定時(shí)間后，用生理鹽水反復(fù)沖洗血污，直至沖洗液接近無色，得處理后的胎盤組織；將胎盤組織進(jìn)行組織消化，用15mmol/L三羥甲基氨基甲烷，加入哈特曼-D溶液，調(diào)節(jié)pH至8.0，作為消化緩沖液，加入終濃度為2.4g/L HyQTase和300U/mL DNase I組成的消化液，取消化液200mL，將沖洗后的胎盤組織分多次進(jìn)行消化，每次在37±0.2°C、200r/min恒溫氣浴搖床消化3min，消化完畢后，220目濾網(wǎng)過濾，收集單細(xì)胞，無菌去除HyQTase溶液，用新生牛血清終止消化反應(yīng)，得到單細(xì)胞懸液；(2)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的初步傳代培養(yǎng):將步驟(I)的單細(xì)胞懸液調(diào)整單細(xì)胞密度為I X 15個(gè)/mL，接種于25mm細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37°C ,5% CO 2濃度的CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天進(jìn)行換液，細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶底面積60 %時(shí)，加入HyQTase和300U/mL DNase I組成的消化液消化4min，加等體積新生牛血清終止消化，用D-Hank’ s液稀釋5倍后，室溫下100g離心12min，棄上清，吹打混勻；[0當(dāng)前第1頁1 2 本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法，其特征在于包括以下步驟：(1)胎盤標(biāo)本處理，得處理后的胎盤組織；將胎盤組織進(jìn)行組織消化，用15mmol/L三羥甲基氨基甲烷，加入哈特曼?D溶液，調(diào)節(jié)pH至8.0，作為消化緩沖液，加入終濃度為2.4g/L?HyQTase和300U/mL?DNase?I組成的消化液，取消化液200mL，將沖洗后的胎盤組織分多次進(jìn)行消化，每次在37±0.2℃、200r/min恒溫氣浴搖床消化3min，消化完畢后，220目濾網(wǎng)過濾，收集單細(xì)胞，無菌去除HyQTase溶液，用新生牛血清終止消化反應(yīng)，得到單細(xì)胞懸液；(2)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的初步傳代培養(yǎng)：將步驟(1)的單細(xì)胞懸液調(diào)整單細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，接種于25mm細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37℃，5％CO2濃度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天進(jìn)行換液，細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶底面積60％時(shí)，加入HyQTase和300U/mL?DNase?I組成的消化液消化4min，加等體積新生牛血清終止消化，用D?Hank’s液稀釋5倍后，室溫下1000g離心12min，棄上清，吹打混勻；(3)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的進(jìn)一步分離與培養(yǎng)：用含體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12、丙酮酸鹽、10毫克/升亞硒酸鈉胰島素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克/mL的bFGF、增殖促進(jìn)劑配制成懸浮液，所述增殖促進(jìn)劑為凝結(jié)的臍帶血液的液體成分，將步驟(2)獲得的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行重懸，在微重力環(huán)境下，計(jì)數(shù)并接種于75mm的培養(yǎng)瓶，在培養(yǎng)基中補(bǔ)充4mg/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子、10ng/ml?N?乙酰基～L?半胱氨酸、100ng/ml氯化鈣，放入37℃、二氧化碳濃度為0.5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2天換液1次，細(xì)胞生長至90％融合后，消化并計(jì)數(shù)細(xì)胞，細(xì)胞傳代后生長速度較快，細(xì)胞形態(tài)比較均一，變化形態(tài)明顯的第2天用100ng/ml的BMP4處理，第3天或4用10ng/ml的BMP4處理，第5天用1ng/ml的BMP4處理，到第6天時(shí)，用差速貼壁法將未貼壁的上層除掉，然后向培養(yǎng)瓶中補(bǔ)加無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待培養(yǎng)8～9天時(shí)細(xì)胞開始出現(xiàn)老化現(xiàn)象，此時(shí)需要注入一種抗氧化劑，所述抗氧化劑為聚乙二醇?綴合過氧化氫酶或N?乙酰半胱氨酸，抑制間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老，用于增加干細(xì)胞產(chǎn)量，待培養(yǎng)10～13天后即可獲得人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞原代細(xì)胞。...

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：夏凡，
申請(專利權(quán))人：夏凡，
類型：發(fā)明
國別省市：山東;37