大豆根瘤內生菌及其應用，生防菌劑及生物促生菌劑制造技術

本發明專利技術公開了一種大豆根瘤內生菌及其應用，生防菌劑及生物促生菌劑，屬于作物栽培種植及作物病害生物防治技術領域。本發明專利技術中大豆根瘤內生菌為粘質沙雷氏菌(Serratia?sp.)DSer1305(保藏編號：CCTCC?NO:M?2013624)，是從大豆根瘤樣品中分離出的一株內生細菌，為革蘭氏陽性菌；菌體呈短桿狀，無芽孢，菌落呈乳白色，邊緣圓整、突起有光澤，表面有皺褶；該菌能產生鐵載體和果膠酶，抗小麥赤霉病菌并促進小麥發芽及幼苗生長，可用于制備生防菌劑和生物促生菌劑。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術設及一種大豆根瘤內生菌，同時還設及該內生菌的應用，W及采用該內生 菌制備的生防菌劑及生物促生菌劑，屬于作物栽培種植及作物病害生物防治

技術介紹
小麥是我國大宗作物，但是每年仍依靠施用大量化肥來提高產量，而過量施用化 肥會對±壤結構和生態環境產生極大破壞，同時對有益微生物的生存構成威脅，并且化學 藥劑過度使用易誘導病菌產生抗藥性，給糧食安全帶來嚴重問題。目前，開發和篩選微生物 促生菌來研發生物促生菌劑，對保持綠色農業和生態環境的可持續發展具有重要意義。 上壤微生物如Azospirillumsp. ,Enterobactersp. ,Pseudomonas sp.,Klebsiellasp.,Serratiasp.,Bacillussp.Enterobactersp.,Pantoea sp. ,Liste;riasp.Xanthomonassp. ,Mic;rococ州sspp.等均對作物生長具有促進作用，其 中分離自小麥和草類根際的固氮菌Bacillus能有效提高作物產量和干物質重量，分離自 黑麥草根際的化terobacterludwgii對提高黑麥草莖、根的鮮重和高度有明顯的促進作 用，分離自小麥根部的Xanthomonassp.Xs148對冬小麥具有促生長作用，等等。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種大豆根瘤內生菌。 同時，本專利技術還提供一種大豆根瘤內生菌的應用。 最后，本專利技術再提供一種能夠抑制小麥赤霉病菌的生防菌劑，W及促進小麥發芽 和幼苗生長的生物促生菌劑。 為了實現W上目的，本專利技術所采用的技術方案是： 大豆根瘤內生菌，其名稱為粘質沙雷氏菌（Serratiasp. )DSerl305,保藏編號： CCTCCN0:M2013624,保藏日期：2013年12月1日，保藏單位：中國典型培養物保藏中屯、 (CCTCC)，保藏地址：中國武漢.武漢大學（湖北省武漢市武昌塔挪山武漢大學保藏中屯、）。 粘質沙雷氏菌（Serratiasp. )DSe;rl305是從大豆根瘤樣品中分離出的一株內生 細菌，經革蘭氏染色菌體呈紫色，為革蘭氏陽性菌。該菌呈短桿狀，大小0. 5X0. 8μηι左右， 無芽抱；菌落呈乳白色，大小3~5mm，邊緣圓整、突起有光澤，表面有皺權。 大豆根瘤內生菌的應用，包括：粘質沙雷氏菌（CCTCCNO:Μ2013624)在制備鐵載 體和/或果膠酶中的應用，在制備抑制小麥赤霉病菌的生防菌劑中的應用，W及在制備促 進小麥發芽和幼苗生長的生物促生菌劑中的應用。此外，還包括在防治小麥赤霉病害、促進 小麥發芽和幼苗生長中的應用。 W11] 用于防治小麥赤霉病害的生防菌劑，其包含粘質沙雷氏菌（CCTCCΝ0:Μ2013624)〇 用于促進小麥發芽和幼苗生長的生物促生菌劑，其包含粘質沙雷氏菌（CCTCC N0:M2013624)。 本專利技術的有益效果： 本專利技術中大豆根瘤內生菌為粘質沙雷氏菌（Serratiasp. )DSerl305(保藏編號： CCTCCN0:M2013624)，是從大豆根瘤樣品中分離出的一株內生細菌，為革蘭氏陽性菌；菌 體呈短桿狀，無芽抱，菌落呈乳白色，邊緣圓整、突起有光澤，表面有皺權；該菌能產生鐵載 體和果膠酶，抗小麥赤霉病菌并促進小麥發芽及幼苗生長，可用于制備生防菌劑和生物促 生菌劑。 保藏證明和存活證明說明 保藏菌株：粘質沙雷氏菌（Serratiasp.)DSerl305,保藏編號：CCTCCN0:M 2013624,保藏日期：2013年12月1日，保藏單位：中國典型培養物保藏中屯、（CCTCC)，保藏 地址：中國武漢.武漢大學（湖北省武漢市武昌塔挪山武漢大學保藏中屯、）?！靖綀D說明】 圖1為粘質沙雷氏菌DSer1305經革蘭氏染色后的菌體形態； 圖2為菌株DSer1305的菌落形態； 圖3為菌株DSerl305的生長規律曲線圖； 圖4為菌株DSerl305對小麥赤霉病菌的抑制效果； 圖5為菌株DSer1305產鐵載體的圖片； 圖6為菌株DSer1305產果膠酶的圖片； 圖7為接種菌株DSer1305對小麥幼苗生長的影響。【具體實施方式】 下述實施例僅對本專利技術作進一步詳細說明，但不構成對本專利技術的任何限制。 陽〇2引實施例1 大豆根瘤內生菌的分離、純化和保存，包括： 1)取河南栽培型大豆根瘤，先用無菌水沖洗根瘤表面4次（3~5次均可），W去除 表面灰塵，再用無水乙醇浸泡25s(20~30s均可），W去除表面極性物質，使用4%次氯酸 鋼（3%~5%均可）消毒4min(3~5min均可），然后用無菌水沖洗6次巧~8次均可）， 用無菌綴子夾碎根瘤，將汁液劃在牛肉膏蛋白腺培養基表面（配方：牛肉膏3g，蛋白腺lOg， 化Cl5g，瓊脂18g，水1000血；自然抑），28°C倒置培養4d(3~5d均可）；2)根據菌落特征挑取單菌落反復劃線（菌落典型特征為乳白色，邊緣圓整、突起 有光澤，表面有皺權），經染色、鏡檢，直至獲得純種單菌落；3)將純種單菌落接種在牛肉膏蛋白腺斜面培養基上，培養至菌苔飽滿，短期保存 在4°C冰箱內，長期保存在30% (v/v)甘油中并置于-80°C冰箱內；同時吸取100μΙ最后 一次沖洗過根瘤的水，涂布在牛肉膏蛋白腺培養基表面，28°C培養4她，觀察有無菌落長出， W驗證表面消毒的徹底性。1、菌體特征 大豆根瘤內生菌經革蘭氏染色菌體呈紫色，為革蘭氏陽性菌（見圖1)。該菌呈短 桿狀，大小0. 5X0. 8μπι左右，無芽抱；菌落呈乳白色，大小3~5mm，邊緣圓整、突起有光 澤，表面有皺權（見圖2)。接種在YM液體培養基中，30°C、130巧m振蕩培養72h，每小時測 定600nm波長的吸光度值（OD)，生長規律曲線見圖3。 2、菌株分子鑒定 陽03引大豆根瘤內生菌經16SrDNA序列擴增（引物P1、P6為通用引物，序列見SEQID NO. 2、SEQIDNO. 3,擴增序列大小為1406bp，序列見沈QIDNO. 1，基因序列號KT964299)， 送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。根據測序結果，將擴增得到的序列在GenBank中 進行BLAST分析，用DNAMAN6. 0進行序列相似性分析，16SrRNA結果表明該菌株與Serratia marcescensN-2(JX868557)的相似率為 100%。 結合分子鑒定結果及菌體特征，命名該菌株為粘質沙雷氏菌（Serratiasp.) DSerl305,并送至中國典型培養物保藏中屯、保藏，保藏編號：CCTCCN0:M2013624,保藏日 期：2013年12月1日，保藏地址：中國武漢.武漢大學（湖北省武漢市武昌塔挪山武漢大 學保藏中屯、）。 陽0對試驗例 1、粘質沙雷氏菌DSerl305抑制小麥赤霉病菌特性 采用對時培養法測定菌株DSerl305對小麥赤霉病菌的抑制作用，包括： 1)制備菌懸液：在超凈工作臺上用無菌接種環挑取適量DSerl305接種到滅過菌 的牛肉膏蛋白腺液體培養基內（不含瓊脂），置于恒溫搖床30°C震蕩13化pm培養4d后 (4~5(1均可），1000化/111111冷凍離屯、10111111收集菌體，使用0.9%無菌生理鹽水調整菌懸 液00日。。> 1，本文檔來自技高網...

【技術保護點】
大豆根瘤內生菌，其特征在于：該菌的名稱為粘質沙雷氏菌(Serratia?sp.)DSer1305，保藏編號：CCTCC?NO:M?2013624。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：趙龍飛，徐亞軍，侯怡婷，張夢瑤，李亞楠，李小雨，彭頂華，
申請(專利權)人：商丘師范學院，
類型：發明
國別省市：河南;41