一種基于虛擬波矢調制的熒光超分辨顯微裝置及方法制造方法及圖紙

本發明專利技術公開了一種基于虛擬波矢調制的熒光超分辨顯微方法，當用激發光掃描物體的某一點時，用探測器陣列記錄到該點在像面上成的艾里斑的光強信息，通過對其加載不同的數字圖樣可對該陣列信息進行虛擬波矢調制，再將陣列的所有點光強相加作為該掃描點的圖像信息；原本被成像系統帶寬所截止的樣品信息的高頻成分被編碼于調制后的圖像信息中；對樣品二維掃描后，得到物體經過虛擬波矢調制后的圖像；然后通過迭代算法從調制后的圖像中重構出物體的超分辨圖像。本發明專利技術還公開了一種基于虛擬波矢調制的熒光超分辨顯微裝置。本發明專利技術采用探測器陣列，通過虛擬波矢調制的方法除了可獲得同等的背景噪聲的抑制效果，還可獲得了更高的橫向分辨率。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于共聚焦顯微領域，特別涉及一種基于虛擬波矢調制的熒光超分辨顯微方法及裝置。
技術介紹
共聚焦顯微鏡利用激光束經光學系統形成的點光源對樣品內物鏡焦平面的每一點進行掃描。樣品上的被照射點，在探測針孔處成像，而焦平面以外的點不會在探測針孔處成像。樣品上被照射點的圖像信息由探測針孔后的光電探測器逐點接收，迅速在計算機監視屏上形成熒光圖像。例如，公開號為CN102830102A的專利文獻提供的一種基于空心聚焦光斑激發的共聚焦顯微方法，激光光束經位相編碼后轉換為圓偏振光；2)將所述圓偏振光通過顯微物鏡聚焦到待測樣品上形成空心聚焦光斑并激發熒光；對所述待測樣品的表面進行掃描并收集激發熒光，獲取不同位置的光強度信息，并計算得到相應的顯微圖像。但根據衍射理論，顯微鏡的分辨能力與波長和數值孔徑有關，減小波長和增大數值孔徑都能提高分辨率，但都無法突破衍射極限，不能真正大幅度地提高分辨率。從1990年起，熒光超分辨顯微鏡被廣泛應用在生物細胞成像中，包括受激輻射損耗顯微鏡(STED)、熒光輻射差分顯微鏡(FED)、光敏定位顯微鏡(PALM)、隨機光學重構顯微鏡(STORM)和結構光照明顯微鏡(SIM)。這些熒光超分辨顯微方法都能實現超分辨成像，但同時存在三大類問題：(1)有限的熒光標記物質；(2)噪聲及像差；(3)低光學切片能力。
技術實現思路
本專利技術在共聚焦顯微鏡的基礎上，提出了一種基于虛擬波矢調制的熒光超分辨顯微方法及裝置，在通用的共聚焦顯微鏡裝置基礎上，用一個探測器陣列代替傳統的點探測器，將探測器陣列置于物方焦平面來接受樣品的圖像信息。當用激發光掃描物體的某一點時，用探測器陣列記錄到該點在像面上成的艾里斑的光強信息，通過對其加載不同的數字圖樣可對該陣列信息進行虛擬波矢調制，再將陣列的所有點光強相加作為該掃描點的圖像信息。由此，原本被成像系統帶寬所截止的樣品信息的高頻成分被編碼于調制后的圖像信息中。對樣品二維掃描后，得到物體經過虛擬波矢調制后的圖像。本專利技術設計了一種獨特的迭代算法，從調制后的圖像中重構出物體的超分辨圖像，并復原出激發光路的光學傳遞函數。本專利技術的具體技術方案如下：一種基于虛擬波矢調制的熒光超分辨顯微方法，針對熒光樣品(被兩類熒光蛋白標記)包括以下步驟：(1)激光器發出激發光束，首先經第一透鏡準直，經第一反射鏡反射、第一二色鏡反射后進入掃描振鏡系統；經掃描振鏡系統導向的激發光再經掃描鏡后在聚焦于掃描鏡后焦面；聚焦于掃描鏡后焦面的激發光再經過場鏡和顯微物鏡聚焦于物體上的一點；掃描振鏡系統掃描時候，在掃描鏡的后焦面上形成掃描區域，場鏡和顯微物鏡共同構成一個成像系統掃描鏡后焦面上的掃描區域成像于物體上；(2)當激光聚焦于所述熒光樣品的某一點時，該點被激發光激發發射熒光被顯微物鏡收集，再經過場鏡、掃描鏡后返回入掃描系統；經過掃描系統返回來的熒光再經第一二色鏡透射后，經濾波片濾除散射光，再經放大系統放大，將樣品上該點發出的艾里斑成像于探測器陣列；(3)所述探測器陣列將光信號轉換為電信號并傳給計算機，計算機用余弦分布的數字圖樣對探測到的陣列信息進行虛擬波矢調制，再將調制后的陣列強度全部相加作為物體該點的圖像信息，由此對樣品的每一個點都可得到一個經過虛擬波矢調制后的強度信息。通過掃描振鏡對物體進行二維掃描，最終可得到一幅經過虛擬波矢調制的物體圖像；(4)用具有不同空間頻率的余弦分布的數字圖樣調制陣列信息，會得到含有物體不同頻譜成分的圖像；本專利技術設計了一套獨特的迭代算法將物體的高頻信息解調出來重構出物體的超分辨圖像，同時可通過迭代算法復原出激發光路的光學傳遞函數；(7)通過控制z軸壓電平臺，可得到樣品不同深度的調制圖像，再通過迭代算法解調可得到樣品不同深度的二維超分辨圖像，從而重構出樣品的三維超分辨圖像。本專利技術還提供了一種基于虛擬波矢調制的熒光發射微分顯微裝置，針對熒光樣品包括：激光器，用于發出激發光束，實現對熒光樣品的照明激發；透鏡，用于對激發光束進行準直；反射鏡，用于反射準直后的激發光束；二色鏡，用于反射激發光束和透射樣品發射出的熒光；掃描振鏡，通過控制掃描振鏡使得激發光束聚焦在樣品的不同點上激發熒光，同時使發出的熒光返回聚焦在探測器位置，實現對樣品的二維掃描；掃描鏡，用于形成掃描區域；場鏡，與顯微物鏡共同構成成像系統將掃描區域成像在樣品上；顯微物鏡，用于將激發光聚焦于樣品上，并收集樣品激發出的熒光；濾波片，濾除收集到的熒光中的散射光；放大系統，將物點的艾里斑的像放大成像于探測器陣列上；探測器陣列，用于記錄每掃描一個點時焦面上的艾里斑信息；計算機，用于記錄探測器陣列信息，對其進行數字調制，并通過迭代算法解調出樣品高頻信息，重構出高分辨率圖像和激發光路系統的光學傳遞函數。z軸壓電平臺：用來控制樣品高度，從而使得激發光對樣品不同深度的截面進行二維掃描；本專利技術中，掃描振鏡和z軸壓電平臺的作用可由三維平移臺替代，用于樣品的二維掃描以及改變掃描深度。本專利技術中，探測器陣列包括多個探測器單元，各探測器緊密排布，排列方式包括但不僅限于矩形陣列和蜂窩狀陣列，例如6×6方形陣列。本專利技術原理如下：在通用的振鏡掃描的共聚焦顯微鏡裝置基礎上，用一個探測器陣列代替傳統的點探測器，置于物方焦平面來接受樣品的空間信息。當用激發光掃描物體的某一點時，用探測器陣列記錄到該點在像面上成的艾里斑的光強信息，并通過加載數字圖樣的方式對該陣列信息進行虛擬波矢調制，再將調制后的光強陣列相加作為該掃描點的圖像信息。對被測樣品進行二維掃描，即可得到一幅經過虛擬波矢調制的物體的二維圖像。用具有不同空間頻率的余弦分布的數字圖樣調制陣列信息，會得到含有物體不同頻譜成分的圖像；再通過一套獨特的迭代算法將物體的高頻信息解調出來重構出物體的超分辨圖像和激發光路的光學傳遞函數。具體原理闡述如下：當物面上的某點r被激發時，如果不使用振鏡，成像面的探測器陣列接收到的強度分布為Inon-descan(rd；r)＝∫hex(rs-r)s(rs)hde(rd-rs)drs(1)式中，rd，rs分別表示探測平面和樣品面的坐標，s表示樣品的空間分布，hex和hde分別表示激發光路和探測光路的點擴散函數。當熒光信號被振鏡導回時，像面的探測器陣列接收到的強度分布可以通過給Inon-descan加載一本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于虛擬波矢調制的熒光超分辨顯微方法，其特征在于，包括以下步驟：1)采用激發光束對熒光樣品進行激發，并通過探測器陣列收集所激發熒光的光強信息；2)用余弦分布的數字圖樣對探測到的光強信息進行虛擬波矢調制，再將調制后的強度信息相加作為樣品掃描點的圖像信息；3)對熒光樣品進行二維掃描，得到一幅經過虛擬波矢調制的樣品圖像；4)重復步驟2)和步驟3)中的操作，并采用具有不同空間頻率的余弦分布的數字圖樣調制所述的光強信息，得到含有樣品不同頻譜成分的圖像；5)利用迭代算法將所述圖像中樣品的高頻信息解調出來，以重構樣品的二維超分辨圖像。

【技術特征摘要】
1.一種基于虛擬波矢調制的熒光超分辨顯微方法，其特征在于，包
括以下步驟：
1)采用激發光束對熒光樣品進行激發，并通過探測器陣列收集所激
發熒光的光強信息；
2)用余弦分布的數字圖樣對探測到的光強信息進行虛擬波矢調制，
再將調制后的強度信息相加作為樣品掃描點的圖像信息；
3)對熒光樣品進行二維掃描，得到一幅經過虛擬波矢調制的樣品圖
像；
4)重復步驟2)和步驟3)中的操作，并采用具有不同空間頻率的余
弦分布的數字圖樣調制所述的光強信息，得到含有樣品不同頻譜成分的圖
像；
5)利用迭代算法將所述圖像中樣品的高頻信息解調出來，以重構樣
品的二維超分辨圖像。
2.如權利要求1所述的熒光超分辨顯微方法，其特征在于，所述的探
測器陣列為6×6方形陣列，每個探測器對應一個光強信息。
3.如權利要求1所述的熒光超分辨顯微方法，其特征在于，所述數字
圖樣的表達式為：
p(n)(r)=12[1+cos(kp(n)·r)]]]>式中，r為樣品的空間坐標，n表示不同數字圖樣的編號，kp(n)為第n
張余弦分布的數字圖樣的空間頻率。
4.如權利要求1所述的熒光超分辨顯微方法，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：匡翠方，方月，馬也，劉旭，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：浙江;33