牛奶中尿素氮檢測(cè)試劑盒制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種牛奶中尿素氮檢測(cè)試劑盒，屬于畜牧學(xué)、動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)中的尿素氮檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。所述的試劑盒包括96孔反應(yīng)板、濃縮沉淀劑Ⅰ、濃縮沉淀劑Ⅱ、緩沖溶液、酶液、顯色劑Ⅰ、顯色劑Ⅱ和對(duì)照液。應(yīng)用所述試劑盒，根據(jù)樣品液光密度值與空白光密度值之差代入尿素氮吸收曲線，計(jì)算牛奶樣品中尿素氮的含量。本發(fā)明專利技術(shù)使用96孔反應(yīng)板和酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，節(jié)省試劑、檢測(cè)通量大，同時(shí)還有牛奶處理液，進(jìn)行樣品處理。本產(chǎn)品使用方便，適合牛奶中尿素氮的大量檢測(cè)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于畜牧學(xué)、動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)中的尿素氮檢測(cè)
，具體是指一 種牛奶中尿素氮檢測(cè)試劑盒。
技術(shù)介紹
利用牛奶尿素氮(milk urea nitrogen,MUN)來評(píng)價(jià)奶牛日糧能氮平衡、蛋白需要 量、氮利用率、繁殖率以及診斷代謝疾病已成為世界范圍內(nèi)奶牛科學(xué)研究的熱點(diǎn)，而且牛奶 取樣方便，不會(huì)對(duì)奶牛造成應(yīng)激。 測(cè)定MUN的方法主要有二乙酰一肟法、脲酶一波氏比色法、酶聯(lián)速率法、紅外光譜 法。紅外光譜法操作簡(jiǎn)單，速度快，國(guó)外測(cè)定DHI就包括MUN指標(biāo)，國(guó)內(nèi)使用較少。 MUN檢測(cè)試劑盒一般采用分光光度法檢測(cè)，試劑使用量大。檢測(cè)對(duì)象為血樣或尿 樣。牛奶中乳蛋白和乳脂含量高，不能直接使用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，需要進(jìn)行前處理。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)為了解決現(xiàn)有技術(shù)中，牛奶中尿素氮檢測(cè)過程中存在的操作繁瑣、檢測(cè)成 本高、花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、敏感性和特異性較低的問題，提供一種牛奶中尿素氮檢測(cè)試劑盒，本發(fā) 明使用96孔反應(yīng)板和酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，節(jié)省試劑、檢測(cè)通量大，同時(shí)還有牛奶處理液，進(jìn)行 樣品處理。本產(chǎn)品使用方便，適合牛奶中尿素氮的大量檢測(cè)。 本專利技術(shù)提供的牛奶中尿素氮檢測(cè)試劑盒，組成包括:96孔反應(yīng)板、濃縮沉淀劑I、濃 縮沉淀劑Π 、緩沖溶液、酶液、顯色劑I、顯色劑Π 、對(duì)照液，所述96孔反應(yīng)板為96孔平底帶蓋 酶標(biāo)板;所述濃縮沉淀劑I為亞鐵氰化鉀溶液，濃度范圍為2.12~20.6g/dl;所述濃縮沉淀 劑Π 為乙酸鋅溶液，濃度范圍5.8~30g/dl;所述緩沖液為乙二胺四乙酸鈉緩沖液，濃度范 圍為1 %~10 %，pH值為6.0~7.0;所述酶液為尿酶溶液，濃度范圍為5~100U/ml;所述顯色 劑I為酚或其衍生物與亞硝基鐵氰化鉀混合溶液，酚或其衍生物濃度范圍為〇. 05 %~5 % ; 亞硝基鐵氰化鉀濃度范圍〇. 01 %~5% ;所述顯色劑Π 為次氯酸鈉溶液，濃度范圍為1 %~ 1 〇 % ;所述對(duì)照液為已知濃度的尿素對(duì)照品溶液，濃度范圍為〇. 1~1 〇mg/d 1。而且，所述濃 縮沉淀劑I為20X濃縮沉淀劑，使用前以純化水按照體積比1:19的比例稀釋，混勻后使用;所 述濃縮沉淀劑Π 為20X濃縮沉淀劑，使用前以純化水按照體積比l:19v/v的比例稀釋，混勻 后使用。上述的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分含量。 所述的牛奶中尿素氮檢測(cè)試劑盒的使用方法，步驟如下： (1)將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上，注意每種液體試劑 使用前均須搖勻;所述試劑包括濃縮沉淀劑I、濃縮沉淀劑Π 、緩沖溶液、酶液、顯色劑I、顯 色劑Π 和對(duì)照液。所述的濃縮沉淀劑I、濃縮沉淀劑Π 使用前與純化水按照體積比1:19的比 例稀釋。 (2)樣品液； 精密量取牛奶樣品O.lmL，加入0.95mL稀釋后濃縮沉淀劑I，渦旋混合，再加入 0.95mL稀釋后濃縮沉淀劑Π ，禍旋混合，于5000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10min，取上清液作為樣品 液。 (3)96孔反應(yīng)板編號(hào)；取出96孔反應(yīng)板。預(yù)留2個(gè)空白孔，編號(hào)為微孔1和微孔2。 對(duì)照液做5個(gè)濃度，每個(gè)濃度做2孔平行，將對(duì)照液對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)為微孔3~微 孔12，并記錄對(duì)照液微孔所在位置。 剩余微孔按序編號(hào)為微孔13~微孔96,用于檢測(cè)不同牛奶樣品中尿素氮的含量， 每個(gè)牛奶樣品均需按照（2)處理得到相應(yīng)的樣品液。每個(gè)樣品液最少做2孔平行，記錄不同 樣品液對(duì)應(yīng)微孔所在的位置。一個(gè)反應(yīng)板最多可以檢測(cè)42個(gè)不同牛奶樣品。 (4)加對(duì)照液和樣品液； 加入緩沖溶液60μ1到96孔反應(yīng)板中的空白孔； 微孔3~微孔12中分別加對(duì)照液1(^1、2(^1、3(^1、4(^1、6(^1，然后再依次加入緩 沖溶液50μ1、40μ1、30μ1、20μ1、0μ1，使得每個(gè)對(duì)照液對(duì)應(yīng)的微孔中液體體積均為60μ1。 從微孔13開始，2孔平行，分別加樣品液60μ1，至所有樣品液加樣完成;隨即加入緩 沖溶液1〇μ1/孔，輕輕振蕩混勻，加入酶液40μ1/孔輕輕振蕩混勻，蓋上蓋后，置37 °C避光環(huán) 境中反應(yīng)20min。 (5)顯色； 加入顯色劑I100μΙ/孔，隨即加入顯色劑Π 50μ1/孔，輕輕振蕩混勻，蓋上蓋后，置 37°C避光環(huán)境中反應(yīng)20min。 (6)測(cè)定； 設(shè)定酶標(biāo)儀于630nm處，以微孔1和微孔2為空白，測(cè)定每孔光密度(0D)值。 (7)結(jié)果； 計(jì)算平行孔0D值的平均值，分別得到空白0D值，對(duì)照液0D值及樣品液0D值。以對(duì)照 液孔對(duì)照液加入體積1〇μ1、20μ1、30μ1、40μ1、60μ1為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的對(duì)照液0D值與空白0D值 的差值為縱坐標(biāo)，計(jì)算尿素氮吸收曲線。把樣品液0D值與空白0D值之差代入尿素氮吸收曲 線，計(jì)算相應(yīng)的體積V。按下式計(jì)算牛奶樣品中尿素氮的含量： 尿素氮含量= v/3X lmg/dl。 本專利技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和有益效果是： (1)本專利技術(shù)制備的試劑盒可用于牛奶中尿素氮的快速定量檢測(cè)，具有使用方便、檢 測(cè)準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。 (2)本專利技術(shù)制備的試劑盒的精密度批內(nèi)變異系數(shù)(CV% )，CV%〈 10 %。準(zhǔn)確度以回 收率表示，回收率應(yīng)在70 %~110 %之間。線性相關(guān)系數(shù)R2:不小于0.9900。【附圖說明】圖1為本專利技術(shù)實(shí)施例中96孔反應(yīng)板編號(hào)示意圖； 圖2為本專利技術(shù)實(shí)施例中96孔反應(yīng)板上顯色示意圖； 圖3為本專利技術(shù)實(shí)施例中得到的尿素氮吸收曲線示意圖。【具體實(shí)施方式】 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本專利技術(shù)進(jìn)行詳細(xì)說明。 本專利技術(shù)提供一種牛奶中尿素氮檢測(cè)試劑盒，所述的檢測(cè)試劑盒中試劑包括濃縮沉 淀劑I、濃縮沉淀劑Π 、緩沖溶液、酶液、顯色劑I、顯色劑Π 和對(duì)照液，還包括一個(gè)帶蓋96孔 板，具體為： 1.處理液制備： 濃縮沉淀劑I:稱取4.24g亞鐵氰化鉀，用超純水溶解并定容至100mL。 濃縮沉淀劑Π :稱取8.76g乙酸鋅，用超純水溶解并定容至100mL。 2.緩沖溶液： 稱取lg乙二胺四乙酸鈉溶于100mL超純水中，用lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至 6.5〇 3.酶液:稱取尿酶lg，用上述緩沖溶液溶解并定容至50mL。 4.顯色劑[00411 顯色劑I:稱取苯酚2.0g，亞硝基鐵氰化鈉 O.lg，用超純水溶解并定容至100mL。 顯色劑II :5%次氯酸鈉溶液； 5.對(duì)照液:稱取尿素標(biāo)準(zhǔn)品0.1071g，用超純水溶解并定容至50mL;精密量取lmL， 用超純水定容至100mL。 應(yīng)用上述得到的試劑盒進(jìn)行變異系數(shù)及回收率測(cè)定，具體步驟如下： 第一步，將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上，注意每種液體 試劑使用前均須搖勻； 用超純水按照體積比1:19的比例分別稀釋適量濃縮沉淀劑I和濃縮沉淀劑Π 。 第二步，樣品液； 精密量取牛奶0. lmL加0.95mL稀釋后濃縮沉淀劑I，渦旋混合，加0.95mL稀釋后濃 縮沉淀劑Π ，渦旋混合，于5000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10min，取上清液作為樣品液。共重復(fù)做5次， 分別為樣品液1、樣品液2、樣品液3、樣品液4、樣品液5。 精密量取l當(dāng)前第1頁(yè)1 2 本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
牛奶中尿素氮檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述的試劑盒包括96孔反應(yīng)板、濃縮沉淀劑Ⅰ、濃縮沉淀劑Ⅱ、緩沖溶液、酶液、顯色劑Ⅰ、顯色劑Ⅱ和對(duì)照液，所述96孔反應(yīng)板為96孔平底帶蓋酶標(biāo)板；所述濃縮沉淀劑Ⅰ為亞鐵氰化鉀溶液，濃度范圍為2.12～20.6g/dl；所述濃縮沉淀劑Ⅱ?yàn)橐宜徜\溶液，濃度范圍5.8～30g/dl；所述緩沖液為乙二胺四乙酸鈉緩沖液，濃度范圍為1％～10％，pH值為6.0～7.0；所述酶液為尿酶溶液，濃度范圍為5～100U/ml；所述顯色劑Ⅰ為酚或其衍生物與亞硝基鐵氰化鉀混合溶液，酚或其衍生物濃度范圍為0.05％～5％；亞硝基鐵氰化鉀濃度范圍0.01％～5％；所述顯色劑Ⅱ?yàn)榇温人徕c溶液，濃度范圍為1％～10％；所述對(duì)照液為已知濃度的尿素對(duì)照品溶液，濃度范圍為0.1～10mg/dl；所述濃縮沉淀劑Ⅰ和濃縮沉淀劑Ⅱ使用前分別以純化水按照體積比1:19的比例稀釋，混勻后使用；上述的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分含量。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：馬建民，孫健，喬利敏，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：北京;11