本發明專利技術公開了一種利用重組大腸桿菌直接從葡萄糖發酵生產反式-4-羥脯氨酸的方法,該方法是先將突變后的γ-谷氨酸激酶基因(proB2A)與連有色氨酸串聯啟動子的反式-4-羥脯氨酸的脯氨酸羥化酶基因(hyp)重組到合適的載體上,構建proB2A與hyp的共表達體系,然后將此共表達體系導入到大腸桿菌中,得到的重組菌能夠實現在無外源L-脯氨酸的條件下,能夠高效的利用葡萄糖直接發酵生產反式-4-羥脯氨酸,從而降低了發酵生產反式-4-羥脯氨酸的成本,提高了經濟效益。本發明專利技術還公開了所述大腸桿菌在羥脯氨酸生產中的應用。
【技術實現步驟摘要】
—種利用重組大腸桿菌無外源L-脯氨酸發酵生產反式-4-羥脯氨酸的方法,屬于微生物基因工程領域。
技術介紹
反式-4-輕脯氨酸(trans-4-hydroxy-L_proline,Hyp)是L-脯氨酸輕基化后的產物,是亞氨基酸的一種。反式-4-羥脯氨酸最早發現于動物膠原蛋白中,因其有兩個不對稱碳原子而有四種立體異構體,是一個重要的手性合成元件,廣泛應用于醫藥、化工、食品、美容等行業。隨著反式-4-羥脯氨酸應用領域的不斷擴展,其生產方法也在逐漸發生變化,目前主要的生產方法是水解法和微生物發酵法。其中,由于水解法過程復雜、產生大量廢棄物、成本高等原因,逐漸被淘汰,而微生物發酵法能更好的解決這方面的問題,越來越受人們關注。微生物發酵法是通過生物細胞表達的脯氨酸-4-羥化酶,將游離的脯氨酸轉化為反式-4-羥基-L-脯氨酸的生產方法。脯氨酸-4-羥化酶催化脯氨酸轉化為羥脯氨酸的過程中,需要以亞鐵離子作為催化輔因子,同時需要酮戊二酸和氧分子的參與。其中,在微生物體內,L-脯氨酸的生產過程是,由α-酮戊二酸形成的谷氨酸,經谷氨酸激酶(pr0B編碼)催化下由ATP提供磷酸基團形成谷氨酰磷酸,又在谷氨酸脫氫酶(proA編碼)作用下將谷氨酸的γ -羧基還原成谷氨酸-T -半醛,然后自發環化形成五元環化合物Λ ’ 二氫吡咯-5-羧酸,再由二氫吡咯還原酶(proC編碼)催化形成脯氨酸。其中脯氨酸能夠反饋抑制谷氨酸激酶,而且proB與proA是作為一個操縱子proBA進行表達的,將proBA突變成proB2A后能夠降低脯氨酸的反饋抑制,大量生產L-脯氨酸。將谷氨酸激酶基因(ProB2A)與連有色氨酸串聯啟動子的反式-4-羥脯氨酸的脯氨酸羥化酶基因(hyp)構建成共表達體系,轉入到宿主菌中,獲得含有該共表達體系的重組菌,能夠在無外源L-脯氨酸的條件下,利用葡萄糖直接連續發酵生產反式-4-羥脯氨基酸,降低發酵生產成本,具有廣闊的應用前景。
技術實現思路
本專利技術旨在無外源L-脯氨酸的條件下,在微生物體內,提高利用葡萄糖直接連續發酵生產反式-4-輕脯氨基酸的產量,降低生產成本。本專利技術所述的利用重組菌發酵生產反式-4-羥脯氨酸的方法,其特征在于,將proBA突變成?抓84后,其編碼的谷氨酸激酶能夠降低L-脯氨酸的反饋抑制,與經優化后的連有色氨酸串聯啟動子的反式-4-羥脯氨酸的脯氨酸羥化酶基因(hyp)構建成合適的共表達體系,將該共表達體系轉入到合適的宿主菌中,在無外源L-脯氨酸的條件下,能夠高效的利用葡萄糖直接連續發酵生產反式-4-羥脯氨酸。本專利技術中的兩種基因只有脯氨酸羥化酶基因(hyp)含有獨立的高效啟動子-色氨酸串聯啟動子(Ptrp2),該啟動子是從已有的重組載體上酶切獲得。本專利技術中的proB2A、hyp共表達體系構建方法是,從已有的重組載體上酶切獲得ProB2A,然后將其連接到含有pET28a-Ptrp2-hyp的重組載體上,獲得pET28a-proB2A_Ptrp2-hyp,然后設計合適的酶切位點8&1^1、恥111,?0?獲得片段?抓84-?壯?2-1^?(8!0,將片段冊通過酶切位點連接到pUC19上,獲得共表達體系pUC19-proB2A-Ptrp2-hyp。本專利技術中所用到的載體必須能夠在宿主內獨立復制,且插入的兩種片段要都能夠隨著載體的復制而各自復制。本專利技術所述重組菌株在發酵反式-4-羥基-L-脯氨酸中的應用,其特征在于,所述的重組菌株在合適的發酵培養基中,于合適的發酵條件下進行培養,依發酵獲得的培養物、細胞體或它們的處理物作為酶源,依葡萄糖為底物,無需額外添加L-脯氨酸,高效利用葡萄糖直接連續發酵生產反式-4-羥基-L-脯氨酸,與之前的發酵生產反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法相比,能夠降低發酵成本提高經濟效益。其中,所用的發酵培養不僅要滿足菌體的擴大生長的需求,而且要適合脯氨酸-反式-4-羥化酶基因的表達;用來羥基化L-脯氨酸的酶源不僅包括脯氨酸-反式-4-羥化酶基因直接編碼合成的酶,還包括依該酶為基礎,經修飾后的具有該酶類似催化活性的蛋白質。本專利技術所生產的反式-4-羥基-L-脯氨酸,將發酵液離心后,分布于上清液中,可通過適當的后處理手段獲得結晶狀的產品。本專利技術發酵液所生產的反式-4-羥基-L-脯氨酸,可通過氯胺-T法檢測,也可以利用高效液相色譜法精確測定。【附圖說明】圖1是單一表達載體pET28a_BH的構建。圖2是單一表達載體pUC19-BH的構建。圖3是含單一表達載體菌株的獲得。【具體實施方式】—般性說明:【具體實施方式】中所用到的酶全部從TaKaRa公司購買,sanprep柱式質粒DNA抽提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均購自上海生工,具體操作完全按照試劑盒的說明。LB培養基:Tryptone 10g/L,Yeast extract 5g/L,NaCl 10g/L,pH 7.0_7.2ο發酵培養基:GlucoselOg/L,Tryptone 8g/L,K2HP043g/L,NaCl 2g/L,MgSO40.2g/L,FeSO4ImM ,CaCl20.015g/L。Amp抗性平板:I %Tryptone,0.5%Yeast extract, I %NaCl ,Ampicillin sodiumsalt 100yg/mLoKan抗性平板:I %Tryptone,0.5%Yeast extract, I %NaCl ,Kanamycin sulfate50yg/mLo5XKCM緩沖液:0.5M KC1,0.15M CaCl2,0.25M MgCl2。反式-4-羥脯氨酸的測定方法:將發酵液離心后,取上清,稀釋后取2.5mL于1mL試管中,加入ImL氯胺T(氯胺T溶液:將1.41g氯胺T溶于1mL水中,依次加入1mL正丙醇和80mL緩沖溶液,其中緩沖溶液配方為:將50g檸檬酸,26.3g NaOH和146.1g結晶乙酸鈉溶于水至1L,然后與200mL水以及300mL正丙醇混合),搖勾后在室溫中放置20min;然后加入ImL顯色劑(顯色劑:稱取1g對二甲氨基苯甲醛,用35mL高氯酸溶解,緩慢加入65mL異丙醇),搖勻后迅速將試管置于60°C水浴鍋中,20min后取出冷水冷卻,用分光光度計在560nm波長處測定吸光度值。實施例1:含有proB2A的重組質粒(pET28a-proB2A)的獲得將實驗室冷凍保存的含有pET28a-pr0B2A的菌株進行活化,于37°C,220rpm培養12-16小時,取培養后的菌液按照sanprep柱式質粒DNA抽提試劑盒說明書提取質粒。實施例2:含有hyp的重組質粒(pUC19-Ptrp2_hyp)的獲得將實驗室冷凍保存的含有pUC19-Ptrp2-hyp的菌株進行活化,于37°C,220rpm培養12-16小時,取培養后的菌液按照sanprep柱式質粒DNA抽提試劑盒說明書提取質粒。實施例3:重組質粒 pET28a-proB2A-Ptrp2_hyp 的構建利用限制性內切酶EcoR1、BamHI從重組質粒pUC19-Ptrp2-hyp中獲得片段Ptrp2-hyp ,然后用EcoR1、BamHI處理重組質粒pET28a_proB2A,將酶處理后的片段Ptrp2_hyp本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一株在無外源L?脯氨酸條件下發酵生產反式?4?羥脯氨酸的重組菌的構建方法,是將proB2A、Ptrp2?hyp重組到質粒pUC19、pET28a上,構建重組質粒pUC19?proB2A?Ptrp2?hyp(pUC19?BH)、pET28a?proB2A?Ptrp2?hyp(pET28a?BH),然后該重組質粒轉化到大腸桿菌中,實現proB2A、hyp在大腸桿菌中的共表達,該重組菌能夠在無外源L?脯氨酸條件下發酵生產反式?4?羥脯氨酸。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員:張震宇,姚動邦,王曉姣,黃建華,魏照輝,
申請(專利權)人:江南大學,
類型:發明
國別省市:江蘇;32
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