本發明專利技術涉及生物技術領域，具體而言，涉及HSV1-H129-BAC及其變體，該病毒及其突變體帶有細菌人工染色體BAC，能在特定的細菌內保持低拷貝的自我復制，解決了因皰疹病毒基因組過大而不能長時間保存、不能自我復制、不方便進行分子生物學突變改造的缺點。且該病毒及其突變體還帶有GFP報告基因，大大拓展了皰疹病毒作為工具病毒的應用前景。本發明專利技術還提供了H129-BAC及其變體的構建方法，通過該方法可使對H129進行改造獲得H129-BAC，并賦予H129-BAC更多的變體種類；構建方法和H129及其變體組成了一個遺傳改造平臺,具有更多的應用可能。
【技術實現步驟摘要】
[00011本專利技術涉及生物
，具體而言，涉及HSV1-H129-BAC及其變體的構建方法與 應用。
技術介紹
單純皰疼病毒(Human Herpesvirus，HSV)屬于α皰疼病毒亞科，該型病毒共分為兩 種類型，I型單純皰疹病毒和Π 型單純皰疹病毒，即HSV1和HSV2ASV1和HSV2都是DNA病毒， 其中HSV1基因組全長為152kb，共編碼超過80種不同的病毒蛋白，病毒質粒大小約180nm。 HSV1對動物感染宿主范圍較廣。常用實驗動物為家兔、豚鼠及小鼠等。HSV1可以在多種細胞 中增殖，常用非洲綠猴腎細胞(Vero細胞）、人胚腎細胞以及地鼠腎細胞等傳代細胞培養分 咼病毒。 HSV1-H129是一個典型的順行標記神經環路的工具病毒，其具有嚴格順向跨突觸 的特性，適合標記多級神經輸出環路的結構；其可攜帶多種標示物，跨突觸后可復制，信號 不衰減，這種未改造的原始株可被直接用于中樞及外周感覺神經環路的研究。在靈長類動 物的大腦中，HSV1-H129也具有同樣的順向跨突觸特性，使其成為極具潛力的示蹤工具。然 而，在順行標記神經環路的應用中，對HSV1-H129的檢測卻比較困難，目前常通過免疫組織 化學或免疫組織熒光等方法對其進行檢測，但這些實驗操作繁瑣復雜，實驗成本較高，最主 要的是對抗體的要求較高，否則很難得到準確的實驗結果，這大為限制了 HSV1-H129在順行 標記神經環路中的應用。 眾所周知，皰疹病毒是一類大分子量的DNA病毒，其基因組全長一般都超過100kb， 要在如此巨大分子量的基礎上研究病毒單個基因的功能和致病機理十分困難，基因組本身 不能長時間保存，且不能自我復制，更不能進行分子生物學的突變改造等一系列的實驗操 作。也因此，使得上述實驗及對皰疹病毒作為工具病毒的其他應用，或基于該病毒的藥物 篩選等應用都難以進一步得到發展。 有鑒于此，特提出本專利技術。
技術實現思路
本專利技術的第一目的在于提供一種I型單純皰疹病毒感染性克隆H129-BAC，該病毒 帶有細菌人工染色體BAC，能在特定的細菌內（如0町(《、0￥380』1^50、0￥330和631783等)保 持低拷貝的自我復制，解決了因皰疹病毒基因組過大而不能長時間保存、不能自我復制、不 方便進行分子生物學突變改造的缺點。且該病毒帶有GFP報告基因，大大拓展了皰疹病毒作 為工具病毒的應用前景。 本專利技術的第二目的在于提供一種所述的I型單純皰疹病毒感染性克隆H129-BAC的 構建方法，通過該方法能構建H129-BAC的感染性克隆，也能對H129-BAC基因組進行分子水 平的改造，包括插入外源基因、缺失一個或者多個病毒基因等，這樣構建了一個基于BAC的 遺傳改造平臺，為HSV的復制機制和致病機理提供了研究工具，具有巨大的應用價值。 本專利技術的第三目的在于提供所述的I型單純皰疹病毒H129-BAC的變體病毒H129-GFP-BAC和H129-mGFP-BAC具有和野生型病毒相似的生物學特性，可以通過報告基因 GFP的 表達情況來觀測重組病毒在細胞內的感染情況，與H129-BAC相比，重組病毒H129-GFP-BAC 和HI 29-mGFP-BAC的GFP表達信號更強，應用更方便。 本專利技術的第四目的在于提供所述的I型單純皰疹病毒H129-BAC的變體病毒的構建 方法，該方法簡單可行，且通過應用該方法可使得更多H129-BAC的變體的實現變為可能，賦 予HI 29-BAC更多的變體種類，具有更多的應用前景。 本專利技術的第五目的在于提供所述的病毒在順行標記神經環路中的應用，HSV1-H129病毒是目前已知的少有的順向跨突觸傳播的病毒，可用于標記神經環路，本申請提供 的HI 29-BAC自帶熒光信號，可使其在神經環路研究中更為方便;其變體病毒含有2-3個拷貝 的GFP基因，比H129-BAC的應該信號更強，熒光效率高，熒光色澤與背景色澤對比鮮明，標 記后能保持生物學活性和免疫活性，標記方法簡單、快速，安全無毒。 本專利技術的第六目的在于提供所述的病毒在病毒藥物篩選中的應用。 為了實現本專利技術的上述目的，特采用以下技術方案： 一種I型單純皰疹病毒感染性克隆H129-BAC，所述感染性克隆H129-BAC通過在 H129的第46616與46617位堿基之間插入BAC序列得到； 所述BAC序列為pUS-F5質粒使用Hindlll酶切所得，所述pUS-F5質粒序列為SEQ ID NO: 1所示。 H129的GenBank號為：GU734772.1;BAC之上包含GFP基因，因而改造得到的H129-BAC病毒帶有GFP蛋白。 細菌人工染色體(Bacterial artificial chromosome，BAC)是一種以F質粒(卩_ plasmid)為基礎建構而成的細菌染色體克隆載體，BAC最大的優勢在于具有容納100-300kb 外源插入片段的能力，能穩定遺傳，克隆入BAC載體的基因組在傳代中不會輕易發生缺失、 重組和嵌合現象，并且可以在E.coli中進行各種基因操作，方便、安全而又快捷。 本申請基于BAC的大基因組對HSV1-H129進行改造就是利用F因子的遺傳優勢而建 立的，且進一步的，本申請優選在其中添加了綠色焚光蛋白（Green Fluorescent Protein， GFP)作為報告基因/蛋白，所改造得到的HI 29-BAC具有以下優點： 1)、H129-BAC病毒中的BAC序列解決了因皰疹病毒基因組過大而不能長時間保存、 不能自我復制、不方便進行分子生物學突變改造的缺點。此外，雖然相比野生型HSV1-H129 病毒多加了 一段約9kb大小的BAC基因序列，但是其在蛋白質印跡中的敏感度、效果、生物活 性和與抗體結合的特異性等發面沒有任何的弱化。 2)、病毒中的GFP蛋白DNA分子量小，只有0.72Kb，與目的基因融合后不影響目的基 因的結構功能，大量表達對細胞也無毒性，且對H129-BAC病毒的感染性無影響，得到的病毒 為感染性克隆，可直接作為工具病毒使用。 3)、GFP可自發熒光，便于在實驗中對其檢測。通過GFP的表達，能夠更好的更直接 觀察病毒的感染情況，由于GFP熒光是生物細胞的自主功能，熒光的產生不需要任何外源 反應底物，因此GFP作為一種廣泛應用的活體報告蛋白，其作用是任何其它酶類報告蛋白無 法比擬的。 4)、H129-BAC病毒能夠在間接免疫熒光法（IFA)和蛋白質印跡法(western blot) 實驗方法的配合下深入了解HSV1病毒編碼的蛋白功能，從而為有效地預防和治療由于該病 毒引起的疾病以及HSV1病毒疫苗的研發提供理論基礎。如上所述的I型單純皰疹病毒感染性克隆H129-BAC的構建方法，包括以下步驟： 1)、以野生型H129病毒基因組為模板，擴增其同源重組臂序列并將其克隆到含有 BAC序列的pUS-F5載體中，得到同時含有H129同源重組臂序列及BAC序列的質粒； 2)、將所述同時含有H129同源重組臂序列及BAC序列的質粒線性化并與野生型 H129病毒轉染至同一細胞中，篩選GFP陽性細胞并從中提取得到H129-BAC的總基因組DNA; 3)、將所述含有HI29-BAC的總基因組DNA通過轉化至細胞中并根本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種Ⅰ型單純皰疹病毒感染性克隆H129?BAC，其特征在于，所述感染性克隆H129?BAC通過在H129的第46616與46617位堿基之間插入BAC序列得到；所述BAC序列為pUS?F5質粒使用HindIII酶切所得，所述pUS?F5質粒序列為SEQ?ID?NO:1所示。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：羅敏華，曾文波，江海飛，趙非，諶章舟，徐富強，
申請(專利權)人：中國科學院武漢病毒研究所，
類型：發明
國別省市：湖北;42
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