本發(fā)明專利技術公開了一種原代奶牛乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)方法：將泌乳期奶牛的乳腺組織剪切成組織塊后用膠原酶/透明質(zhì)酸酶消化液消化，將消化后呈乳糜狀的組織塊接種在培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)，1～2天后組織塊周圍即有細胞游離出組織并貼壁生長，之后培養(yǎng)期間，每天采用機械刮除法去除梭形樣成纖維細胞，直至大約4～5天后大量鋪路石樣乳腺上皮細胞成簇成片生長并互相融合時進行首次傳代。首次傳代時利用差速消化法使用胰蛋白酶消除可能混雜的極少量成纖細胞，即得到純度很高的奶牛乳腺上皮細胞。本方法中乳腺上皮細胞可以在短時間從乳糜狀組織中遷出；并且主要采用機械刮除法去除少量混雜的成纖維細胞污染，因此獲得的乳腺上皮細胞損傷小、純度高。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及細胞生物學領域，具體涉及一種快速分離奶牛乳腺上皮細胞的方法。
技術介紹
奶牛乳腺炎是對奶牛養(yǎng)殖業(yè)危害最大、最常見的疾病之一。奶牛乳腺炎所帶來的危害引導著國內(nèi)外學者對乳腺炎從病因、發(fā)病機理、診斷、治療以及預防等多角度、多方面進行了深入的研究，而對乳腺炎的研究最為常用的就是建立體外乳腺上皮細胞感染的乳腺炎細胞模型。此外，乳腺上皮細胞被公認為是制作乳腺生物反應器的靶細胞，即利用體外培養(yǎng)的乳腺上皮細胞，基于轉基因技術平臺使外源基因?qū)雱游锘蚪M中并定位表達于動物乳腺，在動物的乳汁中生產(chǎn)一些具有重要價值產(chǎn)品，如小分子多肽或蛋白質(zhì)。另外，乳腺上皮細胞也是從細胞水平研究乳蛋白表達、奶牛乳腺發(fā)育和泌乳機制以及作為抗病轉基因奶牛育種供體細胞的有利工具。從1957年Lasfargures利用膠原酶消化法第一次實現(xiàn)乳腺上皮細胞的直接培養(yǎng)開始(Lasfargues E Y.Cultivat1n and behav1r in vitro of the normal mammaryepithelium of the adult mouse.The Anatomical Record，1957，127(I):117-129.)，對奶牛乳腺上皮分離培養(yǎng)的研究和探索已經(jīng)有半個多世紀的歷史。目前對奶牛乳腺上皮分離的方法有酶消化法、組織塊培養(yǎng)法、機械破碎法和乳汁分離法等。酶消化法是通過膠原酶、透明質(zhì)酸酶或者胰蛋白酶等作用于剪成碎塊的組織，獲得分散的細胞后經(jīng)離心、洗滌等步驟接種培養(yǎng)，此方法對于酶的選擇及消化時間比較難于掌握，消化不足則不易獲得可用于足以擴大再培養(yǎng)的細胞數(shù)量，消化過度會導致細胞的損傷。組織塊培養(yǎng)法是將乳腺組織剪成Imm3左右小塊直接接種于培養(yǎng)皿，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)直到乳腺上皮從組織塊周圍迀出生長，該方法最大的不足是耗時長，一般I周或者是更長時間才有細胞迀出，而且往往是成纖維細胞最先迀出生長，需要傳代數(shù)代以后才有可能獲得相對較純的乳腺上皮細胞，傳代次數(shù)的過多極易導致乳腺上皮細胞的老化。機械破碎法就是通過物理學處理手段，將組織塊解離成分散的細胞后用濾網(wǎng)過濾，離心棄去上清液，用培養(yǎng)液懸浮后接種培養(yǎng)，單一使用該方法對乳腺上皮細胞這種分化程度較高的細胞易造成傷害，細胞的存活率相對較低。乳汁分離法是采用離心法收集乳汁后從中提取乳腺上皮細胞，經(jīng)過體外誘導培養(yǎng)獲得乳腺上皮細胞，該方法分離的乳腺上皮細胞雖然沒有成纖維細胞的污染，但是因為乳汁中乳腺上皮細胞含量少，且為自然脫落的細胞，組胞活性差，很難維持生長。除對奶牛乳腺上皮細胞進行原代分離培養(yǎng)外，研究者們還在努力建立永生化的奶牛乳腺上皮細胞系。1991年加拿大的Huynh等利用SV40大T抗原基因轉染奶牛原代乳腺上皮細胞，建立了永生化的奶牛乳腺上皮MAC-T細胞系(Huynh H T1Robitaille G1Turner JD.Establishment of bovine mammary epithelial celIs(MAC-T):an in vitro modelfor bovine lactat1n.Experimental cell research，1991，197(2):191-199.)。之后，在 1995年Huynh等(Huynh H,Poliak M.HH2A,an immortalized bovine mammaryepithelial cell line, expresses the gene encoding mammary derived growthinhibitor(MDGI).1n Vitro Cellular&Developmental B1logy-Animal,1995,31(1):25-29.)和1996年zaviz1n等(Zaviz1n B, van Duffelen M，Schaeffer ff , etal.Establishment and characterizat1n of a bovine mammary epithelial cellline with unique properties.1n Vitro Cellular&Developmental B1logy-Animal ,1996,32(3):138-148.)相繼建立了H2A和BME-UV等永化生細胞系。這些永化生的細胞系雖然保持著部分與起源細胞相似的生物學特性和功能，但在使用的過程中出現(xiàn)了形態(tài)上的分化或沒有腺上皮的典型特點，有的尚未得到其它實驗室的檢驗，而且只是用于實驗室之間的交流使用，到目前為止尚沒有商品化的奶牛乳腺上皮細胞系可為研究人員使用。綜上所述，由于無商品化的奶牛永生化細胞系，以及其在使用過程中性狀和功能的不確定性，而原代細胞系更能代表體內(nèi)器官的功能特性，再加上一般體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞可以穩(wěn)定培養(yǎng)數(shù)月，能滿足細胞實驗的基本要求。因此，目前大多數(shù)實驗室首選分離奶牛原代乳腺上皮細胞進行研究，因此，對乳腺上皮分離培養(yǎng)的方法不斷完善顯得尤其重要。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術的目的在于克服現(xiàn)有奶牛乳腺上皮細胞分離培養(yǎng)技術的不足，提供一種快速分離高純度原代奶牛乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)方法。為達到上述目的，本專利技術采用了以下技術方案:I)將奶牛乳腺組織剪切成0.5?Imm3大小的組織塊，將所述組織塊用磷酸鹽緩沖液清洗后置于膠原酶/透明質(zhì)酸酶消化液中消化30?40分鐘；2)經(jīng)過步驟I)后，通過離心收集消化成乳糜狀的組織塊，將消化成乳糜狀的組織塊接種在培養(yǎng)皿中，并向培養(yǎng)皿中加入細胞培養(yǎng)液，然后于37°C進行培養(yǎng);培養(yǎng)I?2天后，開始每天機械刮除從消化成乳糜狀的組織塊迀出生長的成纖維細胞，保留同樣迀出生長的乳腺上皮細胞，并且每隔I?2天更換細胞培養(yǎng)液I次，直到培養(yǎng)至5?7天時機械刮除所述培養(yǎng)皿中所有殘余組織塊，然后棄掉細胞培養(yǎng)液，并用磷酸鹽緩沖液沖洗；3)經(jīng)過步驟2)后，向所述培養(yǎng)皿中加入胰蛋白酶消化液進行短時消化，短時消化過程中每隔I?2分鐘進行觀察，待乳腺上皮細胞簇最外層的細胞開始變圓時棄掉胰蛋白酶消化液，并用磷酸鹽緩沖液沖洗，然后(短時消化后)向所述培養(yǎng)皿中再次加入胰蛋白酶消化液并進行傳代。優(yōu)選地，所述步驟I)中，奶牛乳腺組織的獲取方法包括以下步驟:無菌采集泌乳期奶牛乳腺組織，經(jīng)表面消毒處理后在不含脂肪組織、結締組織少且富含乳腺小葉的部位切取一部分乳腺組織。優(yōu)選地，所述表面消毒處理包括以下步驟:將奶牛乳腺組織用75%酒精沖洗30?40秒后，再用含抗生素的磷酸鹽緩沖液沖洗3?5次。優(yōu)選地，所述膠原酶/透明質(zhì)酸酶消化液按照每毫升DMEM/F12培養(yǎng)液中加入0.5?1.5mg膠原酶、200?300yg透明質(zhì)酸酶、100IU青霉素、10yg鏈霉素和0.2?0.5yg兩性霉素B進行配制。優(yōu)選地，所述步驟I)中，膠原酶/透明質(zhì)酸酶消化液的用量為每I克剪切成0.5?Imm3大小的組織塊使用2?4毫升。優(yōu)選地，所述細胞培養(yǎng)液為含有體積分數(shù)為10?20%胎牛血清、100IU/mL青霉素、100yg/mL鏈霉素和0.2?0.5yg/mL兩性霉素B的DMEM/F12培養(yǎng)液。優(yōu)選地，所述步驟2)中，細胞培養(yǎng)液的用量為每I克剪切成0.5?Imm3大小的組織塊本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
一種原代奶牛乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于：包括以下步驟：1)將奶牛乳腺組織剪切成0.5～1mm3大小的組織塊，將所述組織塊用磷酸鹽緩沖液清洗后置于膠原酶/透明質(zhì)酸酶消化液中消化30～40分鐘；2)經(jīng)過步驟1)后，通過離心收集消化成乳糜狀的組織塊，將消化成乳糜狀的組織塊接種在培養(yǎng)皿中，并向培養(yǎng)皿中加入細胞培養(yǎng)液，然后于37℃進行培養(yǎng)；培養(yǎng)1～2天后，開始每天機械刮除從消化成乳糜狀的組織塊遷出生長的成纖維細胞，保留同樣遷出生長的乳腺上皮細胞，并且每隔1～2天更換細胞培養(yǎng)液1次，直到培養(yǎng)至5～7天時機械刮除所述培養(yǎng)皿中所有殘余組織塊，然后棄掉細胞培養(yǎng)液，并用磷酸鹽緩沖液沖洗；3)經(jīng)過步驟2)后，向所述培養(yǎng)皿中加入胰蛋白酶消化液進行短時消化，短時消化過程中每隔1～2分鐘進行觀察，待乳腺上皮細胞簇最外層的細胞開始變圓時棄掉胰蛋白酶消化液，并用磷酸鹽緩沖液沖洗，短時消化后向所述培養(yǎng)皿中再次加入胰蛋白酶消化液并進行傳代。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：高明清，張涌，張文耀，和桂良，陳青，徐彤，
申請(專利權)人：西北農(nóng)林科技大學，
類型：發(fā)明
國別省市：陜西;61
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