液質聯用檢測血漿中表兒茶素及表兒茶巰代物含量的方法技術

本發明專利技術公開了一種液質聯用法檢測血漿中表兒茶素及表兒茶巰代物含量的方法，包括如下步驟：(1)含藥血漿樣品制備；(2)工作曲線樣品的制備；(3)LC測定條件；(4)MS/MS條件：(5)采用內標法定量，以系列表兒茶素及表兒茶素巰代物在空白血漿的藥物濃度為橫坐標，表兒茶素及表兒茶素巰代物與內標物普萘洛爾的峰面積比值為縱坐標，用加權最小二乘法進行回歸運算，權重系數為1/x2，求得的直線回歸方程，即為工作曲線，使用工作曲線,將含藥血漿樣品中的表兒茶素及表兒茶素巰代物的藥物濃度計算出來。本發明專利技術的方法快速、專屬、準確、靈敏度高。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于醫藥檢測
，涉及一種檢測血漿中表兒茶素及表兒茶巰代物含量的方法。
技術介紹
縮合鞣質具有抗氧化、抗病原微生物、抗炎、降血壓、調血脂、降血糖等多方面的藥理活性，近10年來研究發現縮合鞣質在抗腫瘤、抗HIV、抗風濕等方面有很好的應用前景，金蕎麥縮合鞣質制成的威麥寧已在臨床用作抗腫瘤藥，烏藥莖中寡聚縮合鞣質是抗HIV-1整合酶的主要活性成分，也是其抗炎、抗風濕活性的主要物質基礎。縮合鞣質有效成分縮合單寧類化合物，其在血漿中不易被檢測，目前尚無一種準確精密的方法來測定血漿中的縮和單寧類化合物的含量。
技術實現思路
本專利技術的目的是克服現有技術的不足，提供一種液質聯用檢測血漿中表兒茶素及表兒茶巰代物含量的方法。本專利技術的技術方案概述如下：一種液質聯用法檢測血漿中表兒茶素及表兒茶巰代物含量的方法，包括如下步驟：(1)含藥血漿樣品制備取服用含有縮合鞣質藥物后的動物血漿50μL，加入10μL甲醇、20μL100ng/mL普萘洛爾溶液、50μL50mg/mL鹽酸巰乙胺溶液，渦流混勻后，60℃水浴20min，再加入50μL甲醇，渦流混勻后，離心，取上清50μL加入50μL體積濃度為50％的甲醇水溶液,供LC/MS/MS測定；所述普萘洛爾溶液的溶劑為體積濃度為50％的乙腈-甲醇溶液；所述鹽酸巰乙胺溶液的溶劑為濃鹽酸和甲醇按體積比為1：9配制而成。(2)工作曲線樣品的制備①標準系列溶液的配制取表兒茶素和表兒茶素巰代物的標準品儲備液母液，用甲醇配置成表兒茶素和表兒茶素巰代物的濃度均為1mg/mL的儲備液，再用甲醇分別稀釋，得到兒茶素和表兒茶素巰代物的濃度均為50、100、250、500、1000、2500，5000和10000ng/mL；②取8份空白血漿50μL，分別加入步驟①配得的各個表兒茶素和表兒茶素巰代物的甲醇溶液10μL，配制成相當于表兒茶素和表兒茶素巰代物在血漿中的濃度為10、20、50、100、200、500，1000和2000ng/mL的樣品，再分別加入20μL100ng/mL普萘洛爾溶液、50μL50mg/mL鹽酸巰乙胺溶液，渦流混勻后，60℃水浴20min，再加入50μL甲醇，渦流混勻后，離心，取上清50μL加入50μL體積濃度為50％的甲醇水溶液,供LC/MS/MS測定；所述普萘洛爾溶液的溶劑為體積濃度為50％的乙腈-甲醇溶液；所述鹽酸巰乙胺溶液的溶劑為濃鹽酸和甲醇按體積比為1：9配制而成。(3)LC測定條件液相色譜柱：WatersBEHShieldRP18柱，2.1mm×100mm，1.7um流動相：A：體積濃度0.1％的甲酸水溶液，B：體積濃度0.1％的甲酸乙腈溶液，梯度如下：0-1分鐘，流動相A從95％到90％，流動相B從5％到10％；1-4.8分鐘，流動相A從90％到84％，流動相B從10％到16％；4.8-6.3分鐘，流動相A從84％到60％，流動相B從16％到40％；6.3-6.5分鐘，流動相A從60％到5％，流動相B從40％到95％；6.5-7.5分鐘，流動相A保持5％，流動相B保持95％7.5-7.51分鐘，流動相A從5％到95％，流動相B從95％到5％；7.51-10.0分鐘，流動相A保持95％，流動相B保持5％.流速：0.3mL/min；柱溫：35℃；進樣量：5μL。(4)MS/MS條件：離子源：電噴霧離子源；毛細管電壓：-3.2KV；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：350℃；脫溶劑氣流速：800L/Hr；錐孔氣流速：50L/Hr；檢測方式：正離子；掃描方式：多重反應監測(MRM)；定量離子對：表兒茶素：m/z291.15→139；表兒茶素巰代物：m/z366.25→289.15；內標普萘洛爾：m/z260.15→116.19(5)采用內標法定量，以系列表兒茶素及表兒茶素巰代物在空白血漿的藥物濃度為橫坐標，表兒茶素及表兒茶素巰代物與內標物普萘洛爾的峰面積比值為縱坐標，用加權最小二乘法進行回歸運算，權重系數為1/x2，求得的直線回歸方程，即為工作曲線，使用工作曲線,將含藥血漿樣品中的表兒茶素及表兒茶素巰代物的藥物濃度計算出來。優點：本專利技術通過硫解的方法得到主要成分表兒茶素的巰代物，然后測定血漿樣品中表兒茶素及表兒茶素巰代物濃度的液相色譜-質譜聯用的分析方法，具有快速、專屬、準確、靈敏度高的特點。附圖說明圖1為特異性色譜圖。圖2為定量限10ng/mL色譜圖。圖3為標準曲線200ng/mL色譜圖。圖4為比格犬口服威麥寧膠囊后表兒茶素、表兒茶素巰代物2小時后的血漿樣品色譜圖。圖5a為比格犬口服威麥寧膠囊后表兒茶素及表兒茶素巰代物血藥濃度-時間曲線。圖5b為比格犬口服威麥寧膠囊后總表兒茶素(表兒茶素及表兒茶素巰代物中表兒茶素的總和)的藥物濃度-時間曲線。具體實施方式下面結合具體實施例并結合附圖對本專利技術做進一步闡述，但不限制本專利技術。實施例1檢測方法的確定1.1實驗儀器和試劑儀器：液相色譜儀為WatersACQUITYUPLC(Waters公司)，配有BinarySolventManager，Column，PDA檢測器；色譜柱：WatersBEHShieldRP18(2.1×100mm，1.7mm)；質譜儀為QuattroPremierXE(Waters)，配有電噴霧電離離子源(ESI)和大氣壓化學電離源(APCI)，MasslynxV4.1工作站，UltraSonicCleanerUSKType超聲波清洗器；FA604A電子天平(上海科天電子儀器有限公司)；渦旋混合儀XW-80A(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)TGL-16G高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)移液槍(BIOHTPROLINE)20-200μl；10-1000μl試劑：表兒茶素，購于上海源葉生物科技有限公司，純度≥98％，批號：YA0402SC13；表兒茶素巰代物，由中國中藥公司提供，原純度≥98％，現在HPLC純度為93％；鹽酸普萘洛爾：美國SigmaAldrich公司，純度≥99％，批號：16524AH；威麥寧膠囊，由中國中藥公司提供，批號130401；鹽酸巰乙胺：美國SigmaAldrich公司，純度≥98％，批號MKBQ8406V；甲醇、乙腈和甲酸為色譜純，其它試劑為分析純；屈臣氏蒸餾水；試劑配制：標準品儲備液母液的配制精密稱本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種液質聯用法檢測血漿中表兒茶素及表兒茶巰代物含量的方法，其特征是包括如下步驟：(1)含藥血漿樣品制備取服用含有縮合鞣質藥物后的動物血漿50μL，加入10μL甲醇、20μL?100ng/mL普萘洛爾溶液、50μL?50mg/mL鹽酸巰乙胺溶液，渦流混勻后，60℃水浴20min，再加入50μL甲醇，渦流混勻后，離心，取上清50μL加入50μL體積濃度為50％的甲醇水溶液,供LC/MS/MS測定；所述普萘洛爾溶液的溶劑為體積濃度為50％的乙腈?甲醇溶液；所述鹽酸巰乙胺溶液的溶劑為濃鹽酸和甲醇按體積比為1：9配制而成。(2)工作曲線樣品的制備①標準系列溶液的配制取表兒茶素和表兒茶素巰代物的標準品儲備液母液，用甲醇配置成表兒茶素和表兒茶素巰代物的濃度均為1mg/mL的儲備液，再用甲醇分別稀釋，得到兒茶素和表兒茶素巰代物的濃度均為50、100、250、500、1000、2500，5000和10000ng/mL；②取8份空白血漿50μL，分別加入步驟①配得的各個表兒茶素和表兒茶素巰代物的甲醇溶液10μL，配制成相當于表兒茶素和表兒茶素巰代物在血漿中的濃度為10、20、50、100、200、500，1000和2000ng/mL的樣品，再分別加入20μL?100ng/mL普萘洛爾溶液、50μL50mg/mL鹽酸巰乙胺溶液，渦流混勻后，60℃水浴20min，再加入50μL甲醇，渦流混勻后，離心，取上清50μL加入50μL體積濃度為50％的甲醇水溶液,供LC/MS/MS測定；所述普萘洛爾溶液的溶劑為體積濃度為50％的乙腈?甲醇溶液；所述鹽酸巰乙胺溶液的溶劑為濃鹽酸和甲醇按體積比為1：9配制而成。(3)LC測定條件液相色譜柱：Waters?BEH?Shield?RP18柱，2.1mm×100mm，1.7um流動相：A：體積濃度0.1％的甲酸水溶液，B：體積濃度0.1％的甲酸乙腈溶液，梯度如下：0?1分鐘，流動相A從95％到90％，流動相B從5％到10％；1?4.8分鐘，流動相A從90％到84％，流動相B從10％到16％；4.8?6.3分鐘，流動相A從84％到60％，流動相B從16％到40％；6.3?6.5分鐘，流動相A從60％到5％，流動相B從40％到95％；6.5?7.5分鐘，流動相A保持5％，流動相B保持95％7.5?7.51分鐘，流動相A從5％到95％，流動相B從95％到5％；7.51?10.0分鐘，流動相A保持95％，流動相B保持5％.流速：0.3mL/min；柱溫：35℃；進樣量：5μL。(4)MS/MS條件：離子源：電噴霧離子源；毛細管電壓：?3.2KV；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：350℃；脫溶劑氣流速：800L/Hr；錐孔氣流速：50L/Hr；檢測方式：正離子；掃描方式：多重反應監測(MRM)；定量離子對：表兒茶素：m/z291.15→139；表兒茶素巰代物：m/z?366.25→289.15；內標普萘洛爾：m/z?260.15→116.19(5)采用內標法定量，以系列表兒茶素及表兒茶素巰代物在空白血漿的藥物濃度為橫坐標，表兒茶素及表兒茶素巰代物與內標物普萘洛爾的峰面積比值為縱坐標，用加權最小二乘法進行回歸運算，權重系數為1/x2，求得的直線回歸方程，即為工作曲線，使用工作曲線,將含藥血漿樣品中的表兒茶素及表兒茶素巰代物的藥物濃度計算出來。...

【技術特征摘要】
1.一種液質聯用法檢測血漿中表兒茶素及表兒茶巰代物含量的方法，其特征是包括如下
步驟：
(1)含藥血漿樣品制備
取服用含有縮合鞣質藥物后的動物血漿50μL，加入10μL甲醇、20μL100ng/mL普
萘洛爾溶液、50μL50mg/mL鹽酸巰乙胺溶液，渦流混勻后，60℃水浴20min，再加入50μL
甲醇，渦流混勻后，離心，取上清50μL加入50μL體積濃度為50％的甲醇水溶液,供LC/MS/MS
測定；所述普萘洛爾溶液的溶劑為體積濃度為50％的乙腈-甲醇溶液；所述鹽酸巰乙胺溶液的
溶劑為濃鹽酸和甲醇按體積比為1：9配制而成。
(2)工作曲線樣品的制備
①標準系列溶液的配制取表兒茶素和表兒茶素巰代物的標準品儲備液母液，用甲醇配
置成表兒茶素和表兒茶素巰代物的濃度均為1mg/mL的儲備液，再用甲醇分別稀釋，得到兒
茶素和表兒茶素巰代物的濃度均為50、100、250、500、1000、2500，5000和10000ng/mL；
②取8份空白血漿50μL，分別加入步驟①配得的各個表兒茶素和表兒茶素巰代物的甲
醇溶液10μL，配制成相當于表兒茶素和表兒茶素巰代物在血漿中的濃度為10、20、50、100、
200、500，1000和2000ng/mL的樣品，再分別加入20μL100ng/mL普萘洛爾溶液、50μL
50mg/mL鹽酸巰乙胺溶液，渦流混勻后，60℃水浴20min，再加入50μL甲醇，渦流混勻后，
離心，取上清50μL加入50μL體積濃度為50％的甲醇水溶液,供LC/MS/MS測定；所述普萘
洛爾溶液的溶劑為體積濃度為50％的乙腈-甲醇溶液；所述鹽酸巰乙胺溶液的溶劑為濃鹽酸和
甲醇按體積比為1：9配制而成。
(3)LC測定條件

【專利技術屬性】
技術研發人員：付淑軍，王鵬，戴瑋，肖蘇萍，常新全，左臣強，張守慶，賴東海，
申請(專利權)人：瀚盟測試科技天津有限公司，中國中藥公司，
類型：發明
國別省市：天津;12