用于從混合物富集突變核酸的方法技術

由于非常過量的野生型DNA的同時存在，從生物樣品檢測罕見體細胞突變的存在經常是挑戰性的。本發明專利技術描述了通過排除可擴增的野生型DNA而允許富集突變型DNA的方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】專利

本專利技術涉及核酸化學和核酸擴增的領域。具體地，本專利技術涉及使用可以檢測核酸中的堿基對錯配的化合物和方法富集低豐度突變型目標核酸。
專利技術背景
已知大多數人遺傳疾病和癌癥由核基因中的突變造成。通常，認為突變是遺傳基因座處的特定多態變體。所述突變可以是單個核苷酸差異，經常被稱作點突變。在細胞和組織水平，在特定遺傳基因座處的多態性可以導致顯著改變的細胞行為。然而，因為甚至相對小的細胞或組織樣品可以含有數百萬或數十億含有該特定遺傳基因座的DNA分子，在遺傳基因座處的多態變體的范圍和頻率的表示需要檢測潛在地以非常低頻率存在的等位基因。在大多數情況下，由于非常過量的野生型DNA的同時存在，來自生物樣品的罕見突變的存在的檢測提出了巨大的挑戰。
因此，本領域中需要選擇性和準確地富集低拷貝突變型DNA的方法，使得它們的存在在進行擴增反應(諸如PCR)之后可以是可檢測的。
專利技術概述
本專利技術涉及用于富集樣品中的低豐度等位基因(例如突變型DNA)的方法，所述樣品允許隨后檢測這樣的等位基因。在第一方面，本專利技術涉及從樣品富集核酸混合物中的目標核酸的變體的方法，所述目標核酸以兩種變體序列的形式存在，其中所述變體在單個核苷酸位置處不同，所述方法包括，提供包括所述目標核酸的樣品，其中待富集的變體在大量過量的其它變體中以低豐度存在于所述樣品中；以對于所述目標核酸摩爾過量的濃度提供與所述目標核酸的一條鏈互補的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與親和標記附接且在所述單個核苷酸位置處與待富集的變體完全匹配且在所述單個核苷酸位置處與其它變體具有錯配；提供適合于所述寡核苷酸與所述目標核酸雜交的條件，以生成由所述寡核苷酸和所述目標核酸的任一種變體的一條鏈組成的雙鏈體多核苷酸；使所述雙鏈體多核苷酸與優先僅結合至含有錯配的雙鏈體多核苷酸的錯配嵌入化合物接觸，其中所述化合物進一步能夠用光催化在所述錯配位點處切割所述雙鏈體多核苷酸的一條鏈；使所述雙鏈體多核苷酸經受光，導致產生切割和未切割的雙鏈體多核苷酸兩者；將切割和未切割的雙鏈體多核苷酸兩者應用于親和基質，所述親和基質識別并結合至所述寡核苷酸上的親和標記；提供僅切割的雙鏈體多核苷酸變性的條件并從所述親和基質移除變性的單鏈；且在使未切割的多核苷酸雙鏈體變性的條件下提供緩沖液；并收集含有富集的目標核酸的變體的一條鏈的緩沖液。在一個實施方案中，所述錯配嵌入化合物是Rh(bpy)2(chrysi)3+或Rh(bpy)2(phzi)3+或它們各自的類似物。在另一個實施方案中，本專利技術涉及擴增并檢測富集的目標核酸的變體的進一步步驟。
在第二方面，本專利技術涉及用于從樣品檢測核酸混合物中的目標核酸的突變型等位基因的方法，其中所述突變型等位基因與野生型等位基因在單個核苷酸位置處不同，并且在大量過量的野生型等位基因間以低豐度存在于樣品中，所述方法包括，富集所述樣品中的突變型等位基因，其中所述富集通過以下進行：以對于所述目標核酸摩爾過量的濃度提供與所述目標核酸的一條鏈互補的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與親和標記附接且在所述單個核苷酸位置處與所述突變型等位基因完全匹配且在所述單個核苷酸位置處與野生型等位基因具有錯配；提供適合于所述寡核苷酸與所述目標核酸雜交的條件，以生成由所述寡核苷酸和所述突變型等位基因或所述野生型等位基因的一條鏈組成的雙鏈體多核苷酸；使所述雙鏈體多核苷酸與優先僅結合至含有錯配的雙鏈體多核苷酸的錯配嵌入化合物接觸，其中所述化合物進一步能夠用光催化在所述錯配位點處切割所述雙鏈體多核苷酸的一條鏈；使所述雙鏈體多核苷酸經受光，導致產生切割和未切割的雙鏈體多核苷酸兩者；將切割和未切割的雙鏈體多核苷酸兩者應用于親和基質，所述親和基質識別并結合至所述寡核苷酸上的親和標記；提供僅切割的雙鏈體多核苷酸變性的條件并從所述親和基質移除變性的所述野生型等位基因的單鏈；在使未切割的多核苷酸雙鏈體變性的條件下提供緩沖液；并收集含有富集的目標核酸的突變型等位基因的一條鏈的緩沖液；擴增所述富集的突變型等位基因；且檢測富集的擴增的突變型等位基因的產物或從富集的擴增的突變型等位基因生成的信號。在一個實施方案中，所述錯配嵌入化合物是Rh(bpy)2(chrysi)3+或Rh(bpy)2(phzi)3+或它們各自的類似物。
附圖簡述圖1顯示了基于銠的嵌入劑Rh(bpy)2(chrysi)3+(左)和Rh(bpy)2(phzi)3+(右)的結構，其中N表示氮，Rh表示銠，且R1、R2和R3獨立地選自氫、烷基、芳基、固體支持物和附接親和標記的接頭。
圖2顯示本專利技術的用于富集突變型等位基因的單鏈的方法的圖示。
專利技術詳述
定義除非另外定義，在本文中使用的所有技術和科學術語具有本專利技術所屬領域的技術人員通常理解的含義。以下參考文獻給技術人員提供了在本專利技術中使用的許多術語的一般定義：Singleton等人,DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology(1994年第2版);TheCambridgeDictionaryofScienceandTechnology(Walker編,1988);TheGlossaryofGenetics,第5版,R.Rieger等人(編),SpringerVerlag(1991)；和Hale&Marham,TheHarperCollinsDictionaryofBiology(1991)。本文中使用的以下術語具有歸于它們的含義，除非另有說明。
術語“核酸”是指核苷酸(例如，核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、核苷酸類似物等)的聚合物，并且包含脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、DNA-RNA雜交物、寡核苷酸、多核苷酸、適體、肽核酸(PNA)、PNA-DNA綴合物、PNA-RNA綴合物等，其包含以直鏈或支鏈方式共價連接在一起的核苷酸。核酸通常是單鏈的或雙鏈的，并且通常含有磷酸二酯鍵，盡管在某些情況下，包括可以具有替代主鏈的核酸類似物，包括、例如，磷酰胺(Beaucage等人(1993)Tetrahedron49(10):1925)；硫代磷酸酯(phosphorothioate)(Mag等人(1991)NucleicAcidsRes.19:1437；和美國專利號5,644,048)、二硫代磷酸酯(Briu等人(1989)J.Am.Chem.Soc.111:2321)、O-甲基亞磷酰胺(O-methylphophoroamidite)連接(參見Eckstein,OligonucleotidesandAnalogues:APracticalApproach,OxfordUniversityPress(1992))和肽核酸主鏈和連接(參見，Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc.114:1895)。其它類似物核酸包括具有帶正電荷主鏈的類似物核酸(Denpcy等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:6097)；具有非離子主鏈(美國專利號5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216,141和4,469,863)和非核糖主鏈的類似物核酸，包括在美國專利號5,235,033和5,034,506中描述的類似物核酸。含本文檔來自技高網...

【技術保護點】
從樣品富集核酸混合物中的目標核酸的變體的方法，所述目標核酸以兩種變體序列的形式存在，其中所述變體在單個核苷酸位置處不同，所述方法包括：提供包括所述目標核酸的樣品，其中待富集的變體在大量過量的其它變體中以低豐度存在于所述樣品中；以對于所述目標核酸摩爾過量的濃度提供與所述目標核酸的一條鏈互補的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與親和標記附接且在所述單個核苷酸位置處與待富集的變體完全匹配且在所述單個核苷酸位置處與其它變體具有錯配；提供適合于所述寡核苷酸與所述目標核酸雜交的條件，以生成由所述寡核苷酸和所述目標核酸的任一種變體的一條鏈組成的雙鏈體多核苷酸；使所述雙鏈體多核苷酸與優先僅結合至含有錯配的雙鏈體多核苷酸的錯配嵌入化合物接觸，其中所述化合物進一步能夠用光催化在所述錯配位點處切割所述雙鏈體多核苷酸的一條鏈；使所述雙鏈體多核苷酸經受光，導致產生切割和未切割的雙鏈體多核苷酸兩者；將切割和未切割的雙鏈體多核苷酸兩者應用于親和基質，所述親和基質識別并結合至所述寡核苷酸上的親和標記；提供僅切割的雙鏈體多核苷酸變性的條件并從所述親和基質移除變性的單鏈；且在使未切割的多核苷酸雙鏈體變性的條件下提供緩沖液；并收集含有富集的目標核酸的變體的一條鏈的緩沖液。...

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2013.11.27 US 61/9095871.從樣品富集核酸混合物中的目標核酸的變體的方法，所述目標核酸以兩種變體序列的形式存在，其中所述變體在單個核苷酸位置處不同，所述方法包括：
提供包括所述目標核酸的樣品，其中待富集的變體在大量過量的其它變體中以低豐度存在于所述樣品中；
以對于所述目標核酸摩爾過量的濃度提供與所述目標核酸的一條鏈互補的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與親和標記附接且在所述單個核苷酸位置處與待富集的變體完全匹配且在所述單個核苷酸位置處與其它變體具有錯配；
提供適合于所述寡核苷酸與所述目標核酸雜交的條件，以生成由所述寡核苷酸和所述目標核酸的任一種變體的一條鏈組成的雙鏈體多核苷酸；
使所述雙鏈體多核苷酸與優先僅結合至含有錯配的雙鏈體多核苷酸的錯配嵌入化合物接觸，其中所述化合物進一步能夠用光催化在所述錯配位點處切割所述雙鏈體多核苷酸的一條鏈；
使所述雙鏈體多核苷酸經受光，導致產生切割和未切割的雙鏈體多核苷酸兩者；
將切割和未切割的雙鏈體多核苷酸兩者應用于親和基質，所述親和基質識別并結合至所述寡核苷酸上的親和標記；
提供僅切割的雙鏈體多核苷酸變性的條件并從所述親和基質移除變性的單鏈；且
在使未切割的多核苷酸雙鏈體變性的條件下提供緩沖液；并收集含有富集的目標核酸的變體的一條鏈的緩沖液。
2.權利要求1的方法，其中所述錯配嵌入化合物是Rh(bpy)2(chrysi)3+、Rh(bpy)2(phzi)3+或它們的類似物，如圖1中所示。
3.權利要求2的方法，其中待富集的變體是突變型等位基因，且其它變體是野生型等位基因。
4.權利要求3的方法，其中所述突變型等位基因是突變型EGFR等位基因，且所述野生型等位基因是野生型EGFR等位基因。
5.權利要求3或4的方法，其進一步包括擴增和檢測所述突變型等位基因的步驟。
6.用于從樣品檢測核酸混合物中的目標核酸的突變型等位基因的方法，其中所述突變型等位基因與野生型等位基因在單個核苷酸位置處不同，并且在大量過量的野生型等位基因中以低豐度存在于樣品中，所述方法包括：
富集所述樣品中的突變型等位基因，其中所述富集通過以下進行：
以對于所述目標核酸摩爾過量的濃度提供與所述目標核酸的一條鏈互補的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與親和標記附接且在所述單個核苷酸位置處與所述突變型等位基因完全匹配且在所述單個核苷酸位置處與野生型等位基因具有錯配；
提供適合于所述寡核苷酸與所述目標核酸雜交的條件，以生成由所述寡核苷酸和所述突變型等位基因或所述野生型等位...

【專利技術屬性】
技術研發人員：N舍恩布倫納，A古普塔，K延森，
申請(專利權)人：豪夫邁·羅氏有限公司，
類型：發明
國別省市：瑞士;CH