本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化的組合物和方法，所述組合物包含：20-80?μM?L-抗壞血酸-2-磷酸酯，2-10?ng/ml?TGF?β3，50-150?nM地塞米松，10-50?μg/ml維生素C，10-50?μg/ml脯氨酸，?0.5-5?μg/ml吲哚美辛，1×ITS+1premix，0.5-10?μg/ml的氯地孕酮酯。該組合物在用作培養(yǎng)基的誘導(dǎo)劑時，能夠提高分化活性和分化定向性。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，更具體地涉及間充質(zhì)干細胞向軟骨誘導(dǎo)的組合物及誘導(dǎo)方法。
技術(shù)介紹
間充質(zhì)干細胞是一類具有高度自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，具有很強的自我復(fù)制能力及多向分化潛能，在一定誘導(dǎo)條件下可定向分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞等，近年來作為種子細胞和細胞載體被廣泛應(yīng)用于軟骨組織工程和基因治療。目前采用間充質(zhì)干細胞分化成軟骨細胞的方法一般是將間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)至傳代的間充質(zhì)干細胞后，再在含有定向誘導(dǎo)為軟骨細胞的因子的培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，將間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)成軟骨細胞。但是由于間充質(zhì)干細胞的定向誘導(dǎo)分化受很多不同信號通路的影響，而且誘導(dǎo)培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞的細胞微環(huán)境變化對于間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)分化及其分子結(jié)構(gòu)有著非常重要的影響。因此。導(dǎo)致現(xiàn)有的間充質(zhì)干細胞分化成軟骨細胞的方法所需周期都較長，通常需要2-4周，并且誘導(dǎo)后II型膠原的表達效率較低。舉例而言，關(guān)節(jié)軟骨因損傷而導(dǎo)致退變，甚至發(fā)生退行性骨關(guān)節(jié)炎，隨著人口的老齡化骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率正在逐漸增加。由于沒有神經(jīng)、血管和淋巴的分布，軟骨雖然有一定的自我修復(fù)能力，但是大于5mm以上的局部軟骨損傷就很那進行自我修復(fù)，關(guān)節(jié)炎類軟骨疾病一直不能得到很好的手術(shù)治療。軟骨組織的傳統(tǒng)修復(fù)方法是自體組織分離的軟骨細胞經(jīng)體外培養(yǎng)，但是卻面臨著成熟軟骨組織擴增能力有限，隨著傳代次數(shù)的增加，細胞逐漸老化而喪失增殖能力，難以滿足r>組織構(gòu)建需要和逐漸喪失其原有特性而分化成其他組織的問題。而骨髓干細胞具有自我更新和多功能分化潛能的特性，在適當(dāng)培養(yǎng)條件下可被誘導(dǎo)分化成軟骨細胞，通過體細胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)有可能提供無免疫原性的“通用型”種子細胞，這將為軟骨疾病的治療提供大量的健康備用組織。干細胞向軟骨細胞的分化成為醫(yī)學(xué)界的熱點研究問題之一。CN101014699A公開了一種去分化型軟骨細胞向軟骨細胞的再分化用培養(yǎng)基，其用于使去分化而軟骨特性減弱的去分化型軟骨細胞向原來的軟骨細胞再分化，含有胰島素和從BMP-2及其類似物中選擇的至少一種。CN101748095A公開了一種定向誘導(dǎo)軟骨細胞的方法，具體涉及一種采用人類羊膜上皮細胞定向誘導(dǎo)軟骨細胞的方法，其依據(jù)組織工程基因?qū)W原理，通過體外培養(yǎng)人羊膜上皮細胞，進行羊膜上皮細胞的原代、傳代培養(yǎng)，觀察調(diào)整羊膜上皮細胞基因型，利用細胞因子和BMP-7誘導(dǎo)和調(diào)控其定向誘導(dǎo)分化成軟骨細胞，通過分子生物學(xué)方法檢測誘導(dǎo)分化的細胞的軟骨細胞特性及軟骨細胞活性，明確人羊膜上皮細胞定向誘導(dǎo)軟骨細胞的調(diào)控機制，結(jié)果表明人羊膜上皮細胞可以作為軟骨細胞誘導(dǎo)分化的種子源。CN102399745A公開了一種軟骨干細胞分離培養(yǎng)方法，其中所述的軟骨干細胞為由軟骨組織細胞篩選而來，經(jīng)特定培養(yǎng)基培養(yǎng)條件維持的成纖維樣細胞，具骨、軟骨及脂肪分化能力，與成體細胞相比還具有良好的擴增能力，自原代收獲后可傳至15代以上而保持原來特性，其利用特定培養(yǎng)條件進行篩選，純化出軟骨干細胞，使軟骨干細胞含量在95％以上，此技術(shù)將促進軟骨組織性特異干細胞的收獲和應(yīng)用于骨、軟骨組織工程。CN103146645A公開了一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞成為軟骨細胞的方法，包括如下步驟：獲取間充質(zhì)干細胞和軟骨細胞；將所述軟骨細胞接種于軟骨細胞培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)；將所述間充質(zhì)干細胞接種于插入式細胞培養(yǎng)皿中，再將接種有所述間充質(zhì)干細胞的所述插入式細胞培養(yǎng)皿置于所述軟骨細胞培養(yǎng)液中，并將所述軟骨細胞培養(yǎng)液更換成軟骨細胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基后進行共同培養(yǎng)；其中，所述軟骨細胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中含有甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白1-34。WO2014/078579A1公開了一種用于將成纖維細胞分化成脂肪細胞的方法，其包括：a)在標準條件下將成纖維細胞在成纖維細胞培養(yǎng)基中生長至匯合；b)在第一分化細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞；c)在第二分化細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞；和d)確認脂肪細胞的存在。“轉(zhuǎn)化生長因子β及周期性拉伸應(yīng)變條件下骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨樣細胞的分化”，郝耀等，中國組織工程研究，2014(28)，研究了轉(zhuǎn)化生長因子β對骨髓間充質(zhì)干細胞的軟骨方向分化所具有顯著的誘導(dǎo)作用，研究發(fā)現(xiàn)，周期性拉伸應(yīng)變可以模擬軟骨細胞在體內(nèi)的力學(xué)環(huán)境，對細胞的增殖和分化起著重要的調(diào)節(jié)作用，轉(zhuǎn)化生長因子β及周期性拉伸應(yīng)變在誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨樣細胞分化過程中是否具有協(xié)同作用。CN102899287A公開了一種采用小球法誘導(dǎo)培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞的方法，該方法可以制得無支架軟骨，通過定時晃動離心管使細胞球與管底分離，保證了細胞球與誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基充分接觸，細胞球中的間充質(zhì)干細胞分化狀態(tài)均一，臍帶源間充質(zhì)干細胞相對于常規(guī)的骨髓源間充質(zhì)干細胞分離制備簡便，來源豐富。然而，發(fā)現(xiàn)在該方法中，誘導(dǎo)的定向性仍有待提高，例如仍含義一定量的脂肪細胞、基質(zhì)細胞等其它細胞。本專利技術(shù)人在該專利的基礎(chǔ)上，對其誘導(dǎo)成分進行改進，使得能夠更好地模擬體內(nèi)多因素聯(lián)合調(diào)控的作用，更加有利于促進其軟骨分化，同時通過引用將該專利全文并入本文。
技術(shù)實現(xiàn)思路
為克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，本專利技術(shù)人在上述現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，經(jīng)過深入研究和大量實驗，提出了如下技術(shù)方案。在本專利技術(shù)的一方面，提供了一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化的組合物，該組合物包含：20-80μML-抗壞血酸-2-磷酸酯，2-10ng/mlTGFβ3，50-150nM地塞米松，10-50μg/ml維生素C，10-50μg/ml脯氨酸，0.5-5μg/ml吲哚美辛，1×ITS+1premix(即，10μg/mlInsulin,5.5μg/mltransferrin,5ng/mlselenium,5.35μg/mllinoleicacid)，0.5-10μg/ml下式(I)所示的氯地孕酮酯，所述濃度是指在培養(yǎng)基中的濃度：優(yōu)選地，該組合物包含：50μg/mlL-抗壞血酸-2-磷酸酯，5ng/mlTGFβ3，100nM地塞米松，25μg/ml維生素C，20μg/ml脯氨酸，2.5μg/ml吲哚美辛，1×ITS+1premix，1μg/ml式(I)所示的氯地孕酮酯。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，所述組合物也可以是培養(yǎng)基與上述誘導(dǎo)組分的組合。本專利技術(shù)人發(fā)現(xiàn)，氯地孕酮酯的濃度為1μg/ml可以獲得最佳的分化效果(可例如參見圖1)，濃度繼續(xù)增加，分化效果反而下降，這樣的效果是先前所未本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化的組合物，該組合物包含：20?80μM?L?抗壞血酸?2?磷酸酯，2?10ng/ml?TGFβ3，50?150nM地塞米松，10?50μg/ml維生素C，10?50μg/ml脯氨酸，0.5?5μg/ml吲哚美辛，1×ITS+1premix，0.5?10μg/ml下式(I)所示的氯地孕酮酯，所述濃度是指在培養(yǎng)基中的濃度：
【技術(shù)特征摘要】
1.一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化的組合物，該組合物
包含：20-80μML-抗壞血酸-2-磷酸酯，2-10ng/mlTGFβ3，50-150nM
地塞米松，10-50μg/ml維生素C，10-50μg/ml脯氨酸，0.5-5μg/ml
吲哚美辛，1×ITS+1premix，0.5-10μg/ml下式(I)所示的氯地孕酮
酯，所述濃度是指在培養(yǎng)基中的濃度：
2.根據(jù)權(quán)利1所述的組合物，該組合物包含：50μg/mlL-抗壞血
酸-2-磷酸酯，5ng/mlTGFβ3，100nM地塞米松，25μg/ml維生素C，
20μg/ml脯氨酸，2.5μg/ml吲哚美辛，1×ITS+1premix，1μg/ml式(I)
所示的氯地孕酮酯。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，該組合物還包含10-100
μM的β-甘油磷酸鈉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，該組合物還包含50-200
μM雪蓮和/或藏紅花的提取物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的組合物，該組合物用作培養(yǎng)
基或培養(yǎng)液的成軟骨誘導(dǎo)劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，所述培養(yǎng)基或培養(yǎng)液包括
DMEM培養(yǎng)液、α-MEM培養(yǎng)液中的任一種。
7.一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化的方法，該方法包括：
在15ml尖底離心管中使用小球法誘導(dǎo)培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞，并且每隔
約24小時輕輕晃動離心管一次，使細胞球與管底分離，使用的誘導(dǎo)
\t分化培養(yǎng)基為高糖DMEM中加入權(quán)利要求1-3所述組成和濃度的組
合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)時間為14-21
天。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中，所述間充質(zhì)干細胞
為臍帶源間充質(zhì)干細胞或骨髓間充質(zhì)干細胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，該方法包括以下步驟：
1)...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：安沂華，董健伸，
申請(專利權(quán))人：安沂華，
類型：發(fā)明
國別省市：北京;11
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