病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)技術方案

本發(fā)明專利技術涉及一種核酸序列，其包含與目的核苷酸有效連接的結合位點，其中所述結合位點能夠與RNA結合蛋白相互作用，從而在病毒載體生產(chǎn)細胞內(nèi)抑制目的核苷酸的翻譯。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及病毒載體的生產(chǎn)。更具體而言，本專利技術涉及在病毒載體生產(chǎn)細胞中改變由病毒載體編碼的目的核苷酸的翻譯。
技術介紹
基因治療廣泛涉及使用遺傳物質來治療疾病。它包括在具有缺陷基因(例如，包含突變的那些)的細胞內(nèi)利用這些基因的功能性拷貝進行補充、使不正常工作的基因失活以及引入新的治療基因。治療性遺傳物質可利用載體引入到宿主靶細胞中，從而使得能夠傳遞核酸。這樣的載體一般可以分為病毒類和非病毒類。作為病毒復制循環(huán)的一部分，病毒自發(fā)地將它們的遺傳物質引入到宿主靶細胞中。經(jīng)工程改造的病毒載體利用這種能力，從而能夠向靶細胞遞送目的核苷酸(NOI)。迄今為止，許多病毒已被工程改造為用于基因治療的載體。這些病毒包括逆轉錄病毒、腺病毒(ADV)、腺相關病毒(AAV)、單純皰疹病毒(HSV)和牛痘病毒。除了改造為攜帶目的核苷酸，病毒載體通常還經(jīng)工程改造為復制缺陷型。這樣，重組載體可直接感染靶細胞，但不能產(chǎn)生下一代感染性病毒粒子。其他類型的病毒載體可以為僅在癌細胞內(nèi)具有條件復制能力，并且還可以編碼有毒轉基因或酶原。逆轉錄病毒載體已經(jīng)被開發(fā)為用于治療各種遺傳紊亂，并且目前已經(jīng)表明其在臨床試驗中具有與日俱增的前景(例如，文獻“Galy,A.and A.J.Thrasher(2010)Curr Opin Allergy Clin Immunol 11(6):545-550”；“Porter,D.L.,B.L.Levine,M.Kalos,A.Baggand C.H.June(2011)N Engl J Med 365(8):725-733”；“Campochiaro,P.A.(2012)Gene Ther 19(2):121-126”；“Cartier,N.,S.Hacein-Bey-Abina,C.C.Bartholomae,P.Bougneres,M.Schmidt,C.V.Kalle,A.Fischer,M.Cavazzana-Calvo and P.Aubourg(2012)Methods Enzymol 507:187-198”；“Sadelain,M.,I.Riviere,X.Wang,F.Boulad,S.Prockop,P.Giardina,A.Maggio,R.Galanello,F.Locatelliand E.Yannaki(2010)Ann N Y Acad Sci 1202:52-58”；“DiGiusto,D.L.,A.Krishnan,L.Li,H.Li,S.Li,A.Rao,S.Mi,P.Yam,S.Stinson,M.Kalos,J.Alvarnas,S.F.Lacey,J.K.Yee,M.Li,L.Couture,D.Hsu,S.J.Forman,J.J.Rossi and J.A.Zaia(2010)Sci Transl Med 2(36):36ra43and Segura MM,M.M.,Gaillet B,Garnier A.(2013)Expert opinion in biological therapy”)。這種載體的重要實例包括γ逆轉錄病毒載體系統(tǒng)(基于MMLV)、靈長類動物慢病毒載體系統(tǒng)(基于HIV-1)和非靈長類動物慢病毒載體系統(tǒng)(基于EIAV)。反向遺傳學已經(jīng)使這些基于病毒的載體被大量工程改造，從而可以通過利用適當?shù)腄NA序列轉染哺乳動物細胞來產(chǎn)生編碼大的異源序列(大約10kb)的載體(參見綜述“Bannert,K.(2010)Caister AcademicPress:347-370”)。在研究階段，逆轉錄病毒載體的工程改造和使用通常涉及生產(chǎn)報告基因載體，其編碼(例如)GFP或lacZ。這些臨床上不相關的載體的滴度通常在1×106至1×107轉導單位每毫升(TU/mL)粗收集物的范圍內(nèi)。這種收集物的進一步濃縮和純化可以獲得超過1×1010TU/mL的工作儲存液。然而，與這些報告載體相比，生產(chǎn)編碼治療相關NOI的載體經(jīng)常導致滴度大幅下降。以下幾個因素是這種作用的潛在原因：1.治療性基因組的尺寸。非常大的基因組可以被逆轉錄病毒包裝，但是認為隨著尺寸增加，逆轉錄和/或整合步驟效率降低。2.載體基因組RNA的穩(wěn)定性。該穩(wěn)定性可能由于NOI內(nèi)存在不可預測的不穩(wěn)定因素而降低。3.在載體基因組RNA內(nèi)使用次優(yōu)核苷酸。野生型病毒基因組通常有一定的核苷酸偏好(例如，HIV-1富含AT)。載體基因組往往不太富含AT，這可能會影響包裝和/或后成熟步驟。4.在病毒載體生產(chǎn)細胞內(nèi)的NOI的表達。(過)表達蛋白可能間接或直接影響載體病毒粒子組裝和/或感染性。我們已經(jīng)憑經(jīng)驗證明了在病毒載體生產(chǎn)細胞內(nèi)表達由NOI編碼的蛋白質可以對治療性載體滴度產(chǎn)生不利影響(參見圖3i和3ii)。將由目的核苷酸編碼的蛋白(目的蛋白，POI)引入到載體病毒粒子中也可能會影響載體顆粒的下游加工；例如，編碼跨膜POI的目的核苷酸可能會導致在病毒載體病毒粒子內(nèi)跨膜蛋白的高表面表達，從而潛在地改變該病毒粒子的物理性質。此外，該引入可以在遞送位點將POI呈遞給患者的免疫系統(tǒng)，這可能在體內(nèi)對治療性基因的轉導和/或長期表達產(chǎn)生負面影響。目的核苷酸還可以誘導產(chǎn)生不希望的、會影響生產(chǎn)、純化、回收和免疫原性的二級蛋白或代謝物，因此希望將這些不利影響降至最低程度。對于在病毒載體生產(chǎn)細胞內(nèi)抑制目的核苷酸的表達，同時在靶細胞中保持目的核苷酸有效表達的能力存在明確的需求。無論采用任何機制，病毒載體顆粒組裝的“自然”途徑和所得功能必須不能受到阻礙。然而，這并不簡單，因為將被包裝到病毒粒子中的病毒載體基因組分子必然會編碼目的核苷酸表達盒。換句話說，由于載體基因組分子和目的核苷酸表達盒有效連接，所述目的核苷酸表達盒的改變可能對在細胞內(nèi)產(chǎn)生載體基因組分子的能力造成不良后果。例如，如果將物理轉錄阻礙(例如TetR阻遏系統(tǒng))用于抑制目的核苷酸表達盒，則可能的情況是載體基因組分子的產(chǎn)生通過空間位阻也會被抑制。此外，在病毒粒子成熟和釋放后，控制機制的改變還必須不對載體基因組分子的功能產(chǎn)生不利影響(即，關于指導對靶細胞的轉導)。例如，逆轉錄病毒載體的基因組RNA分子必須能夠進行逆轉錄和整合過程——對于目的核苷酸表達盒的任何改變必須不得妨礙轉導過程中的這些步驟。抑制病毒載體生產(chǎn)細胞內(nèi)的目的核苷酸表達可能會具有進一步的優(yōu)點。如果目的核苷酸的表達導致載體生產(chǎn)細胞的活力降低，則對其的抑制可有益于需要大量細胞數(shù)的大規(guī)模生產(chǎn)。在粗載體收集物內(nèi)，由于細胞死亡導致的細胞碎片的減少也會使雜質降低。載體平臺(即在相同的載體系統(tǒng)中編碼不同的治療性基因)的加工、純化和濃縮可被標準化；如果在載體生產(chǎn)過程中，需要病毒載體生產(chǎn)細胞中僅表達異源基因，則對于治療性載體的整個平臺而言，更易于優(yōu)化下游加工，從而導致載體制劑具有非常相似的物理參數(shù)。可以將獲得的載體的體內(nèi)免疫應答變化性和毒性降至最低，這可導致治療性目的核苷酸在靶細胞內(nèi)更持久的表達。將目的核苷酸的表達限制在生產(chǎn)細胞中的組織特異性啟動子是一種可能解決這個問題的方案，盡管這些啟動子的滲漏可能導致轉基因蛋白的不利水平。然而，可使用組成型啟動子來實現(xiàn)目的核苷酸在靶細胞內(nèi)更多、更強的表達。的確，這樣的強表達可能是體內(nèi)的有效本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種核酸序列，其包含與目的核苷酸有效連接的結合位點，其中所述結合位點能夠與RNA結合蛋白相互作用，從而在病毒載體生產(chǎn)細胞內(nèi)抑制目的核苷酸的翻譯。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2013.12.20 GB 1322798.81.一種核酸序列，其包含與目的核苷酸有效連接的結合位點，其中所述結合位點能夠與RNA結合蛋白相互作用，從而在病毒載體生產(chǎn)細胞內(nèi)抑制目的核苷酸的翻譯。2.根據(jù)權利要求1所述的核酸序列，其中所述RNA結合蛋白為色氨酸RNA結合衰減蛋白(TRAP)。3.根據(jù)權利要求1或2所述的核酸序列，其中所述目的核苷酸在缺乏RNA結合蛋白的靶細胞中進行翻譯。4.根據(jù)前述任一項權利要求所述的核酸序列，其中所述TRAP結合位點包含多個RAGN2-3重復序列。5.根據(jù)前述任一項權利要求所述的核酸序列，其中所述TRAP結合位點包含多個RAGN2重復序列。6.根據(jù)前述任一項權利要求所述的核酸序列，其中所述TRAP結合位點至少包含6個RAGN2重復序列。7.根據(jù)權利要求1至4中任一項所述的核酸序列，其中所述TRAP結合位點至少包含8個RAGN2-3重復序列。8.根據(jù)權利要求7所述的核酸序列，其中RAGNNN重復的數(shù)目為1以下。9.根據(jù)前述任一項權利要求所述的核酸序列，其中所述TRAP結合位點包含8-11個RAGN2重復序列。10.根據(jù)前述任一項權利要求所述的核酸序列，其中所述TRAP結合位點包含11個RAGN2-3重復序列，其中RAGNNN重復的數(shù)目為3以下。11.根據(jù)前述任一項權利要求所述的核酸序列，其中所述目的核苷酸產(chǎn)生治療效果。12.根據(jù)前述任一項權利要求所述的核酸序列，其中所述核酸序列進一步包含RRE序列或其功能性替代物。13.一種病毒載體，包含根據(jù)前述任一項權利要求所述的核酸序列。14.根據(jù)權利要求13所述的病毒載體，其包含多于一個目的核苷酸，并且其中至少一個目的核苷酸有效連接至權利要求1至12中任一項所限定的結合位點。15.根據(jù)權利要求13或14所述的病毒載體，其衍生自逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、單純皰疹病毒、牛痘病毒或桿狀病毒。16.根據(jù)權利要求15所述的病毒載體，其衍生自慢病毒.17.根據(jù)權利要求16所述的慢病毒載體，其衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV或綿羊脫髓鞘性腦白質炎慢病毒。18.一種病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)，其包含一組編碼生產(chǎn)病毒載體所需元件的核酸序列，其中載體基因組包含根據(jù)權利要求1至12中任一項所述的核酸序列。19.根據(jù)權利要求18所述的病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)，其中所述病毒載體衍生自逆轉錄病毒、腺病毒或腺相關病毒。20.根據(jù)權利要求19所述的病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)，其中所述病毒載體是逆轉錄病毒載體，并且所述病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)進一步包含編碼Gag和Pol蛋白、RNA結合蛋白、和Env蛋白的核酸序列，或其功能性替代物。21.根據(jù)權利要求20所述的病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)，其中所述病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)進一步包含編碼rev的核酸序列或其功能性替代物。22.根據(jù)權利要求19至21中任一項所述的病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)，其中所述病毒載體衍生自慢病毒。23.根據(jù)權利要求22所述的病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)，其中所述病毒載體衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV或綿羊脫髓鞘性腦白質炎慢病毒。24.根據(jù)權利要求18至23中任一項所述的病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)，其中所述RNA結合蛋白為色氨酸RNA結合衰減蛋白(TRAP)。25.一種DNA構建體，其用于根據(jù)權利要求18至24中任一項所述的病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)，所述DNA構建體包含根據(jù)權利要求1至12中任一項所述的核酸序列。26.一種DNA構建體，其用于根據(jù)權利要求18至24中任一項所述的病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)，所述DNA構建體包含編碼RNA結合蛋白的核酸序列。27.根據(jù)權利要求26所述的DNA構建體，其中所述構建體包含編碼色氨酸RNA結合衰減蛋白(TRAP)的核酸序列。28.一組DNA構建體，其用于根據(jù)權利要求18至24中任一項所述的病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)，所述一組DNA構建體包含根據(jù)權利要求25所述的DNA構建體、編碼Gag和Pol蛋白的DN...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：丹尼爾·法爾利，基里亞科斯·米特羅帕努斯，
申請(專利權)人：牛津生物醫(yī)學英國有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：英國;GB