本發明專利技術涉及一種用于制備在抗癌免疫療法中使用的施用于人受試者的疫苗制劑的方法，該疫苗制劑具有包含三個表位的優化多肽和作為佐劑的Montanide。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】本專利技術涉及抗癌疫苗領域。更具體地說，本專利技術涉及一種用于制備在抗癌免疫療法中使用的疫苗制劑的方法，該疫苗制劑具有優化的多肽(包含三個表位)和作為佐劑的Montanide。WO2007073768(A1)公開了具有序列Vx006(YLQVNSLQTVYLEYRQVPVYLEEITGYL，SEQ ID NO:1)的多肽，其包含三個通用腫瘤抗原衍生的優化隱蔽性肽(TERT988Y、MAGE-A248V9和HER-2/neu402Y)。與三種肽的簡單混合物不同，并且與包含相同表位但順序不同的其它多肽不同，SEQ ID NO:1的多肽引發針對由腫瘤細胞表達的天然表位TERT988、HER-2/neu402、MAGE-A248G9和MAGE-A248D9的多特異性CTL應答。由于幾乎100％的腫瘤表達三種抗原中的至少一種，從而Vx006成為用于抗癌免疫療法的出色候選物。免疫佐劑是被添加至疫苗制劑以提高其功效的物質。佐劑可以提高由疫苗接種而誘導的免疫應答的強度和持續時間。IFA(不完全弗氏佐劑)是在研究中最常用的佐劑之一。它是從不可代謝油制備。具有IFA的疫苗制劑是油包水(W/O)乳液。IFA通過在注射部位形成儲庫和刺激產生漿細胞的抗體來誘導免疫應答。然而，不良反應，包括在許多情況下需要手術介入的無菌性膿腫和一些臨床前的發現表明，IFA是使實驗室動物致癌的，其妨礙了IFA佐劑疫苗的進一步臨床開發。于是，具有改進的規格和質量控制步驟的IFA型解毒佐劑變得可用。例如，基于礦物油的ISA 51和基于角鯊烯的ISA 720(SEPPIC，France)乳液目前正處于針對癌癥、瘧疾和HIV的疫苗研究的臨床研發中。但是，因為W/O型乳液存留在注射部位，在該注射部位其傾向于引起局部反應，這些W/O乳液佐劑的應用可能仍限于人類的治療性疫苗和癌癥疫苗領域。針對非小細胞肺癌的疫苗，使用ISA51VG的EGF疫苗，正在進行三期研究，并已經至少在古巴獲得許可。ISA 51是高度純化的礦物油(Drakeol 6VR)和表面活性劑(二縮甘露醇單油酸酯)的混合物。在2006年，出于對朊病毒污染的顧慮，ISA 51的制劑從使用由牛油中分離的油酸改變為使用由橄欖分離的油酸(ISA 51VG)。用于執行油包水(W/O)乳化的疫苗的方法可通過多種程序使用不同裝置如高剪切混合器、旋渦、注射器或注射器和連接器(T-或I-連接器)來獲得。用于獲得乳液的方法就疫苗的物理-化學參數和疫苗接種功效而言不是所有都為相同的。傳統上，為了獲得用ISA 51乳化的肽，使用由連接器(I或T-連接器)連接的兩個無硅酮注射器以帶來高剪切從而使水滴被捕獲在周圍油相中。通常情況下，肽溶解在生理鹽水溶液中(最通常為PBS或0.9％NaCl鹽水緩沖液)，一體積的該溶液與一體積的ISA 51混合。然后將混合物裝載至由例如通過I-連接器連接的兩個無硅酮注射器組成的裝置中，其用于執行20個低速循環(即循環持續大約4秒)的預乳化步驟，隨后執行40個快速循環的乳化步驟。如下定義循環：使整個溶液(水相和佐劑)從第一個注射器轉移至另一個，隨后使整個溶液轉移返回其初始注射器。近來，Ascarateil和Koziol報告了通過優化的用于自動W/O乳液過程的新設備獲得的結果(Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2013)。在專利申請EP 2 322 132 A1中公開的這種裝置是自動封閉系統，其允許控制乳化過程。本專利技術人試圖通過上述的通常程序用ISA 51和包含SEQ ID No:1的多肽的水相獲得W/O乳液。當這樣做時，專利技術人遇到了一些不明原因的困難，如以下實驗部分示出的。由于用于用肽溶液和獲得乳液的標準程序失敗了，專利技術人在乳化過程中嘗試了多個參數，但沒有成功。最后，專利技術人令人驚訝地發現，僅當滿足下列兩個條件時，ISA 51VG才能夠乳化SEQ No:1的多肽：-SEQ No:1的多肽必須溶解在純水而不是鹽溶液中；和-預乳化步驟必須包括至少2個非常慢的循環，每個循環持續至少6秒。因此，本專利技術涉及一種用于獲得油包水乳液的方法，所述油包水乳液用于向人受試者施用序列YLQVNSLQTVYLEYRQVPVYLEEITGYL(SEQ ID No:1)的多肽，所述方法包括以下步驟：(i)通過使凍干的SEQ No:1的多肽溶解于純水(注射用水)中來獲得抗原水相；(ii)將一體積的所述抗原水相和一體積的ISA 51裝載至包括由連接器連接的兩個注射器的裝置中；(iii)通過執行使整個制劑從一個注射器轉移到另一個并且然后再返回第一注射器的至少三個循環使制劑預乳化，其中每個循環持續至少6秒；和(iv)通過執行至少15個附加的轉移循環使制劑乳化，其中每個循環持續至多2秒。在本文中，“ISA 51”表示目前市售的ISA 51VG，以及由其衍生的任何生物等效佐劑(例如，由從另一個來源分離的油酸或合成的油酸替換由橄欖分離的油酸)。還應該注意，在步驟(ii)中，水和油相的50/50比例可以變化。事實上，佐劑可以占整個溶液的至多60％。因此，除非另有規定，短語“使一體積的含水相與一體積的ISA 51混合”意味著“以包括50/50至40/60的W/O比例混合含水相和ISA 51”。重要的是，用于執行上述過程的注射器必須適合即其必須是無硅和無橡膠的(即柱塞不含任何橡膠頭)，并且還優選不含膠乳。可用于執行本專利技術的注射器的實例是：-OR 2ml(編號:4606701V，來自B-Braun,德國),-OR 5ml(編號:4606710V，來自B-Braun,德國),-OR 2ml Norm-Ject(編號:4020.000V0，來自Henke Sass Wolf GMBH,德國),-OR 5ml Norm-Ject(編號:4050.000V0，來自Henke Sass Wolf GMBH,德國)。在根據本專利技術的方法中，通過用純無菌水水合SEQ No:1的多肽凍干糕并等待直至溶解完成來執行步驟(i)。當該步驟在10至40℃的溫度下執行時，幾秒至2分鐘是必要的，以獲得凍干糕的完全溶解；如果需要，可以通過用兩個手指拿取小瓶施加一至幾秒的溫和振蕩。也可以在更低溫度下例如在冰箱中(1-4℃)執行該溶解步驟。根據一個具體的實施方案，執行步驟(i)以獲得0.5-6ml，優選約1ml或5ml體積的抗原水相。根據一個具體的實施方案，執行步驟(i)以使得SEQ No:1的肽在抗原水相中的最終濃度為2至20mg/ml，優選2至10mg/ml。在一個具體的實施方案中，通過使一體積的抗原水相裝載至第一注射器并且使至少一體積的ISA 51裝載至第二注射器，然后通過連接器橋接兩個注射器來執行步驟(ii)，以使得最終的水相/ISA 51的比例被包含在50/50至40/60之間。從小瓶轉移液體的最簡單的方法是使用注射器和針頭。但是，這種方法有刺破的風險。另一個更安全的解決方案是使用小瓶適配器，如來自West Pharmaceutical Services,Inc或Promepla(Monaco)的13mm或20mm的小瓶適配器。例如，可以按照如下描述的程序來執行步驟(ii)：·在通過泡罩包裝處理小本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種用于獲得油包水乳液的方法，所述油包水乳液用于向人受試者施用序列YLQVNSLQTVYLEYRQVPVYLEEITGYL(SEQ?ID?No:1)的多肽，所述方法包括以下步驟：(i)通過使凍干的SEQ?No:1的多肽溶解于純的無菌水中來獲得抗原水相；(ii)將一體積的所述抗原水相和一體積的ISA?51裝載至包括由連接器連接的兩個注射器的裝置中；(iii)通過執行使整個制劑從一個注射器轉移到另一個并且然后再返回第一注射器的至少三個循環使制劑預乳化，其中每個循環持續至少6秒；和(ⅳ)通過執行至少20個附加的轉移循環使制劑乳化，其中每個循環持續至多2秒。
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2013.12.18 EP 13306769.41.一種用于獲得油包水乳液的方法，所述油包水乳液用于向人受試者施用序列YLQVNSLQTVYLEYRQVPVYLEEITGYL(SEQ ID No:1)的多肽，所述方法包括以下步驟：(i)通過使凍干的SEQ No:1的多肽溶解于純的無菌水中來獲得抗原水相；(ii)將一體積的所述抗原水相和一體積的ISA 51裝載至包括由連接器連接的兩個注射器的裝置中；(iii)通過執行使整個制劑從一個注射器轉移到另一個并且然后再返回第一注射器的至少三個循環使制劑預乳化，其中每個循環持續至少6秒；和(ⅳ)通過執行至少20個附加的轉移循環使制劑乳化，其中每個循環持續至多2秒。2.權利要求1所述的方法，其中通過用純的無菌水在10至40℃的溫度下水合SEQ No:1的多肽的凍干糕并等待直至溶解完成來執行步驟(i)。3.根據權利要求1或權利要求2所述的方法，其中水溶液中的肽濃度為2至20mg/ml。4.前述權利要求任一項所述的方法，其中通過使一體積的抗原水相裝載至第一注射器并且使一體積的ISA 51裝載至第二注射器，然后通過連接器橋接兩個注射器來執行步驟(ii)。5.前述權利要求中任一項所述的方法...
【專利技術屬性】
技術研發人員：讓娜·梅內雅梅，
申請(專利權)人：瓦克松生物技術公司，
類型：發明
國別省市：法國;FR
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