基于2D和3D的Caco?2細胞對納米氧化鋅生物安全性的評價方法技術

基于2D和3D的Caco?2細胞對納米氧化鋅生物安全性的評價方法，屬于微生物的測定或檢驗方法技術領域，包括如下步驟：1）2D細胞培養；2）3D細胞培養；3）細胞傳代；4）將納米氧化鋅粉末分散在無血清的DMEM培養基中備用；5）進行納米材料表征和細胞形態學觀察，采用MTT比色法檢測細胞活性，對炎癥因子白細胞介素?8進行檢測，借助流式細胞儀檢測不同的細胞死亡方式；使用SPSS19.0統計軟件進行分析，對數據進行單因素方差分析，計算p<0.05和p<0.01的差異顯著性。本發明專利技術評估了在2D和3D細胞培養模型中納米氧化鋅對細胞的生物學效應以及對納米氧化鋅毒性。這些研究對于體外探討納米氧化鋅的腸毒性具有一定的理論意義，并為納米氧化鋅限量標準的制定提供參考。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于微生物的測定或檢驗方法
，具體涉及為基于2D和3D的Caco-2細胞對納米氧化鋅生物安全性的評價方法。
技術介紹
目前，納米材料對環境和人類健康影響的研究還不完善，相關的信息比較少。與常規食品材料相比，納米食品材料粒徑較小，與其在理化性質上的差異較大，并且納米材料在機體內的生物活性，以及產生的生物正副效應均得到放大，誘導的細胞毒性也可能會增強。因此，需要大量科學的毒理學權威信息，解釋什么劑量范圍內是危險的，什么劑量范圍內是安全的。在眾多的金屬納米材料中，納米氧化鋅是被廣泛應用的材料之一。納米氧化鋅是一種粒徑在 1～100nm 的新型高功能精細無機材料。與常規氧化鋅相比，納米氧化鋅具有極強的抗氧化性、抗腐蝕性、光催化性和獨特的抗紫外線性，使其在光電學、橡膠工業、涂料陶瓷、化妝品、食品添加劑、生物醫學等方面應用廣泛，而且在光、聲、電納米器件等領域將有著廣闊的應用前景。目前已知納米氧化鋅可通過皮膚接觸、呼吸道、消化道和靜脈注射等途徑進入機體，但機體很難排除這類微小物質，因此潛在一定的毒性效應。物質被納米化后，其毒性、吸收和排泄方式都有所改變。納米氧化鋅的細胞毒理學研究開展較為廣泛，已證明納米氧化鋅對人肺腺癌細胞、人結腸癌細胞、人胚肺成纖維細胞和呼吸道上皮細胞等多種細胞系有毒性作用。細胞是大多數生物體的基本單位，其變化大體上可反映生物機體功能與結構的變化，而當機體功能與結構未發生變化時，細胞功能與結構也可能發生改變。細胞毒理學主要是應用體外細胞技術手段研究環境中物理、化學和生物等多種污染物對細胞的損傷效應與規律，從而獲得該物質的細胞毒效應、與劑量有關的暴露特征（如暴露時間、暴露途徑、暴露頻率）、毒作用機理等諸多信息。以細胞為研究對象進行納米顆粒生物效應研究，主要是應用體外培養的細胞株對納米顆粒進行毒效應監測，評價納米顆粒對人體可能產生的危害。一般測試方法是將傳代細胞或原代細胞置于塑料培養皿，加入一定量的納米材料，然后觀察細胞反應。目前主要采用的細胞類型包括吞噬細胞、神經細胞、上皮細胞、內皮細胞、紅細胞和各種癌細胞。目前涉及的主要檢測項目包括細胞毒性檢測、細胞凋亡檢測以及免疫細胞化學技術。追溯到上個世紀七十年代，各國科學家們意識到癌細胞生長的外環境對其表型形成是非常重要的。很多研究表明正常組織細胞以及癌細胞在傳統二維（2D）塑料培養皿中培養會失去其原有的組織結構與表現，相比體內細胞往往會進行代謝、表型和基因表達的改變，這些改變會影響到癌細胞的發展和功能。Brinster等人發現將胚胎腫瘤細胞接種到小鼠皮下形成了胚胎癌，而將次細胞接種到已孕小鼠胚胎囊里則可以發育成小鼠，這個結果表明腫瘤細胞生長的微環境差異對其形成腫瘤的可能性影響很大。建立在這些理論基礎上，Emerman、Elsdale以及Weaver等人提出可以利用再造細胞外基質（extracellular matrix，ECM）以構成網架結構并支持和連接組織結構來構建體外3D細胞培養模型。3D細胞培養定義為細胞、一些生長因子和再造基質蛋白以及骨架共培養，以模仿體內細胞生長環境的特性。通過模仿體內環境的特性，并利用傳統的細胞培養研究工具，3D細胞培養提供了獨特的視角來觀察干細胞的行為、組織器官和腫瘤的發展過程。細胞在塑料培養皿的表面生長，即只能在二維（2D）平面上生長，但在體內，細胞則被其他細胞、組織和細胞外基質重重包圍。以前科學家們從分子以及基因水平對體外2D細胞進行研究，以探索特定分子和基因改變對細胞生物學行為的影響。盡管體內動物模型更能準確地反映細胞的代謝、表型和基因表達，但實現大規模分子水平的研究也是非常困難的。建立體外3D培養模型將有助于跨越2D細胞培養與動物試驗之間的鴻溝，因為3D細胞培養可以利用傳統的2D細胞培養研究工具，并模擬體內狀態提供細胞生長支架，綜合了2D細胞培養和動物模型的優點。3D細胞培養可以模擬細胞生長的微環境，模擬體內細胞和細胞基質的相互作用，準確反映癌細胞和間質之間作用的機理。同時，3D細胞模型營造出的細胞微環境也更適合于誘導出細胞的極性，這對組織和其產品的直接分泌是很重要的。隨著人們與納米氧化鋅接觸的日益增多，其對人類健康的潛在毒性影響也引起了高度關注。研究納米材料對細胞毒性的眾多試驗中，二維（2D）單層細胞培養仍然是占主導地位的體外模型。在傳統2D塑料培養皿中培養的細胞會失去其原有的組織結構，極性以及蛋白質–蛋白質相互作用，而且相比體內模型往往會改變細胞的代謝、表型以及基因表達。當二維細胞培養模型擴展到納米毒理學研究，它的這些限制有可能導致獲得誤導性結果和結論的風險。實際上在體內的所有細胞都生長在一個三維（3D）環境中，單個細胞的表型和功能是高度依賴于三維組織-細胞外基質（ECM）蛋白和鄰近細胞的復雜相互作用。因此，在一個高度模擬體內生理環境的體外3D模型中進行納米粒子的毒性研究可以為納米材料的生物安全性評價提供更多理論基礎和參考價值。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服上述提到的缺陷和不足，而提供基于2D和3D的Caco-2細胞對納米氧化鋅生物安全性的評價方法。本專利技術實現其目的采用的技術方案如下。基于2D和3D的Caco-2細胞對納米氧化鋅生物安全性的評價方法，其特征在于，包括如下步驟：1）2D細胞培養：將Caco-2 細胞株加入含10% FBS和1% L-谷氨酰胺的完全DMEM培養基中，37 ℃、5% CO2 靜置培養，每隔2~3天換一次細胞培養液，取對數生長期細胞進行后續試驗；2）3D細胞培養：在試驗前將無菌離心管分裝的Matrigel膠置于冰上溶解2~3 h，再將移液器槍頭和96孔培養板置于冰上冷卻1 h；取10~20 μL Matrigel膠均勻的包埋細胞培養板底部，置于37 ℃細胞培養箱30 min使其凝固；消化二維細胞，計數并稀釋至2 x 104/mL，分別吸取50 μL細胞懸液和Matrigel膠，按1:1混勻后轉入96孔培養板，再置于37 ℃細胞培養箱30 min使其凝固；重新凝固的膠上層滴加100 μL 含有10% FBS和1% L-谷氨酰胺的完全DMEM培養基，在條件為37 ℃、5% CO2的培養箱中靜置培養，每隔2~3天換一次完全DMEM培養基；3）細胞傳代：Caco-2細胞貼壁生長，經過3-4 d，細胞生長至單層80%-95%時，棄掉上清液，用適量PBS輕輕沖洗，棄掉廢液，加入0.25%胰蛋白酶進行消化3-5 min，在倒置顯微鏡下觀察到細胞剛剛變圓時，加入少量10%胎牛血清的DMEM培養基終止細胞消化過程，用吸管吸取培養基，輕輕吹打使細胞不再貼壁，將細胞懸液轉移到新的培養瓶中，并加入適量培養基，放入條件為37 ℃、5% CO2的培養箱中培養3-4 d后，進行下一次傳代培養；4）將納米氧化鋅粉末分散在無血清的DMEM培養基中，制成不同濃度納米氧化鋅懸液；放入4 ℃冰箱中備用；每次使用前，需使用使用超聲波細胞破碎儀使納米材料解聚，超聲條件為：3 min，超3 s停2 s，功率300 w；5）進行納米材料表征和細胞形態學觀察，采用MTT比色法檢測細胞活性，對炎癥因子白細胞介素-8（IL-8）進行檢測，通過熒光顯微鏡觀察AO/EB雙染后的2D細胞死亡形態，借助流式細胞儀檢測不本文檔來自技高網...

【技術保護點】
基于2D和3D的Caco?2細胞對納米氧化鋅生物安全性的評價方法，其特征在于，包括如下步驟：1）2D細胞培養：將Caco?2?細胞株加入含10%?FBS和1%?L?谷氨酰胺的完全DMEM培養基中，37?℃、5%?CO2?靜置培養，每隔2~3天換一次細胞培養液，取對數生長期細胞進行后續試驗；2）3D細胞培養：在試驗前將無菌離心管分裝的Matrigel膠置于冰上溶解2~3?h，再將移液器槍頭和96孔培養板置于冰上冷卻1?h；取10~20?μL?Matrigel膠均勻的包埋細胞培養板底部，置于37?℃細胞培養箱30?min使其凝固；消化二維細胞，計數并稀釋至2?x?104/mL，分別吸取50?μL細胞懸液和Matrigel膠，按1:1混勻后轉入96孔培養板，再置于37?℃細胞培養箱30?min使其凝固；重新凝固的膠上層滴加100?μL?含有10%?FBS和1%?L?谷氨酰胺的完全DMEM培養基，在條件為37?℃、5%?CO2的培養箱中靜置培養，每隔2~3天換一次完全DMEM培養基；3）細胞傳代：Caco?2細胞貼壁生長，經過3?4?d，細胞生長至單層80%?95%時，棄掉上清液，用適量PBS輕輕沖洗，棄掉廢液，加入0.25%胰蛋白酶進行消化3?5?min，在倒置顯微鏡下觀察到細胞剛剛變圓時，加入少量10%胎牛血清的DMEM培養基終止細胞消化過程，用吸管吸取培養基，輕輕吹打使細胞不再貼壁，將細胞懸液轉移到新的培養瓶中，并加入適量培養基，放入條件為37?℃、5%?CO2的培養箱中培養3?4?d后，進行下一次傳代培養；4）將納米氧化鋅粉末分散在無血清的DMEM培養基中，制成不同濃度納米氧化鋅懸液；放入4?℃冰箱中備用；每次使用前，需使用使用超聲波細胞破碎儀使納米材料解聚，超聲條件為：3?min，超3?s停2?s，功率300?w；5）進行納米材料表征和細胞形態學觀察，采用MTT比色法檢測細胞活性，對炎癥因子白細胞介素?8進行檢測，通過熒光顯微鏡觀察AO/EB雙染后的2D細胞死亡形態，借助流式細胞儀檢測不同的細胞死亡方式；使用?SPSS19.0統計軟件進行分析，對數據進行單因素方差分析，計算p<0.05和p<0.01的差異顯著性。...

【技術特征摘要】
1.基于2D和3D的Caco-2細胞對納米氧化鋅生物安全性的評價方法，其特征在于，包括如下步驟：1）2D細胞培養：將Caco-2 細胞株加入含10% FBS和1% L-谷氨酰胺的完全DMEM培養基中，37 ℃、5% CO2 靜置培養，每隔2~3天換一次細胞培養液，取對數生長期細胞進行后續試驗；2）3D細胞培養：在試驗前將無菌離心管分裝的Matrigel膠置于冰上溶解2~3 h，再將移液器槍頭和96孔培養板置于冰上冷卻1 h；取10~20 μL Matrigel膠均勻的包埋細胞培養板底部，置于37 ℃細胞培養箱30 min使其凝固；消化二維細胞，計數并稀釋至2 x 104/mL，分別吸取50 μL細胞懸液和Matrigel膠，按1:1混勻后轉入96孔培養板，再置于37 ℃細胞培養箱30 min使其凝固；重新凝固的膠上層滴加100 μL 含有10% FBS和1% L-谷氨酰胺的完全DMEM培養基，在條件為37 ℃、5% CO2的培養箱中靜置培養，每隔2~3天換一次完全DMEM培養基；3）細胞傳代：Caco-2細胞貼壁生長，經過3-4 d，細胞生長至單層80%-95%時，棄掉上清液，用適量PBS輕輕沖洗，棄掉廢液，加入0.25%胰蛋白酶進行消化3-5 min，在倒置顯微鏡下觀察到細胞剛剛變圓時，加入少量10%胎牛血清的DMEM培養基終止細胞消化過程，用吸管吸取培養基，輕輕吹打使細胞不再貼壁，將細胞懸液轉移到新的培養瓶中，并加入適量培養基，放入條件為37 ℃、5% CO2的培養箱中培養3-4 d后，進行下一次傳代培養；4）將納米氧化鋅粉末分散在無血清的DMEM培養基中，制成不同濃度納米氧化鋅懸液；放入4 ℃冰箱中備用；每次使用前，需使用使用超聲波細胞破碎儀使納米材料解聚，超聲條件為：3 min，超3 s停2 s，功率300 w；5）進行納米材料表征和細胞形態學觀察，采用MTT比色法檢測細胞活性，對炎癥因子白細胞介素-8進行檢測，通過熒光顯微鏡觀察AO/EB雙染后的2D細胞死亡形態，借助流式細胞儀檢測不同的細胞死亡方式；使用 SPSS19.0統計軟件進行分析，對數據進行單因素方差分析，計算p<0.05和p<0.01的差異顯著性。2.如權利要求1所述的基于2D和3D的Caco-2細胞對納米氧化鋅生物安全性的評價方法，其特征在于，步驟5）中，所述納米材料表征，包括以下步驟：納米顆粒由無水乙醇超聲混懸，滴加到銅網上干燥透射電鏡下鏡檢；采用馬爾文粒徑儀對納米顆粒進行強度和粒徑分布的分析。3.如權利要求1所述的基于2D和3D的Caco-2細胞對納米氧化鋅生物安全性的評價方法，其特征在于，步驟5）中，所述細胞形態學觀察，包括以下步驟：將2D和3D 培養條件下的Caco-2細胞，進行染毒處理，細胞分別與濃度為10和75 μg/mL的24 nm納米氧化鋅染毒溶液共培養12 h；孵育12 h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態，并拍攝照片；對照組細胞是與無血清的DMEM培養基共培養。4.如權利要求1所述的基于2D和3D的Caco-2細胞對納米氧化鋅生物安全性的評價方法，其特征在于，步驟5）中，采用MTT比色法檢測細胞活性，包括以下步驟：將2D和3D細胞進行染毒處理，即加入0， 10， 25， 50， 75， 100 μg/ml不同濃度的24， 56， 87 nm三種粒徑納米氧化鋅染毒液與細胞共培養12 h；染毒時間結束后，PBS潤洗2次，每孔加入0.05 mg/mL的MTT200 μL，進行...

【專利技術屬性】
技術研發人員：關榮發，陶淼，葉子弘，吳知盼，王彥波，劉明啟，呂飛，
申請(專利權)人：中國計量大學，
類型：發明
國別省市：浙江;33