本發明專利技術提供結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2351c在制備結核病檢測試劑、結核疫苗以及抗結核藥物中的應用。本發明專利技術提供一種新的結核檢測抗原蛋白Rv2351c，與以往采用單一抗原的檢測手段相比，可減少因單一抗原特異性T細胞造成的假陰性，從而提高檢測靈敏度。本發明專利技術的抗原蛋白Rv2351c是結核毒力相關因子，細胞免疫和體液免疫的高強度顯示該抗原具有較強的免疫原性，可用作新型結核疫苗候選抗原。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及分子生物學和免疫學領域，具體地說，涉及結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2351c在制備結核病檢測試劑、結核疫苗以及抗結核藥物中的應用。
技術介紹
結核病是由結核分枝桿菌引起的人畜共患傳染病，根據世界衛生組織統計，目前全球約有1/3的人口感染了結核分枝桿菌，其中約有10％有可能發展為活動性肺結核。我國結核病感染率為44.5％，是全球22個結核病流行嚴重的國家之一、結核病人總數位居第二，僅次于印度。2014年WHO報告顯示2013年有900萬新生病例和150萬人死于結核病，其中36萬屬于HIV陽性病人，48萬屬于多重耐藥結核病人(MDR-TB)，結核分枝桿菌合并人類免疫缺陷病毒感染以及多重耐藥菌株的出現，使得結核病成為嚴重危害人類健康的公共衛生問題。目前，結核病仍是我國傳染病中危害最大的一種疾病，高特異性和高敏感性結核病早期檢測技術及試劑，對于結核病的早期診斷，及時隔離和治療，有效切斷傳染途徑，降低結核病的發病率和死亡率至關重要。結核的診斷一般是依靠實驗室診斷、影像學檢查和臨床診斷等，細菌學診斷中痰涂片染色鏡檢雖然簡單易行，但對樣本的濃度要求較高，通常要含菌量在5000～10000/ml才可檢出陽性，故陽性率低，容易漏檢，樣本合格與否直接決定痰菌檢出率的陽性與否。痰培養是結核病診斷的金標準，但周期長，培養成功率只有80％，不利于快速檢測。臨床上最常用的是皮膚結核菌素實驗，但皮膚實驗受卡介苗(BCG)接種和環境分枝桿菌感染的干擾導致假陽性的出現，使其靈敏度較低，并且需要患者二次就醫。結核的影像學檢查如常規的X線檢查、CT檢查、MRI檢查、超聲檢查等價格昂貴，且對身體產生一定創傷性，特異性低，不適用于常規的檢查診斷。結核分枝桿菌侵入人體后寄居在巨噬細胞內，人體對結核分枝桿菌主要的免疫反應是細胞免疫，主要參與的細胞是CD4+和CD8+T細胞。被病原菌致敏的T淋巴細胞，再次接觸同種抗原后會釋放γ干擾素，高水平的γ干擾素反應可以提示該病原菌的感染。以T細胞為基礎的ELISPOT檢測方法是通過IFN-γ特異性抗體捕獲經結核抗原刺激的外周血淋巴細胞培養后產生的IFN-γ，并以酶聯斑點顯色的方式呈現，從斑點的數量來確定細胞分泌細胞因子的情況，從單細胞水平評價細胞免疫功能。以T細胞為基礎的體外γ干擾素的檢測被用于結核病的輔助診斷，這種檢測方法不僅能篩選出活動性結核病人，同時也能檢測出潛伏期病人，從而能更好地預防和控制潛伏期結核，目前已有以結核分枝桿菌基因組RD1區編碼的結核特異性抗原ESAT-6和CFP-10的全蛋白或多肽為刺激物的商品化IGRA試劑盒，如QuantiFERON-TB Gold test和T-SPOT，均呈現較高的靈敏性和特異性。Rv2351c(GI:15609488)是由結核分枝桿菌基因組差異區RD7編碼的結核分枝桿菌特異性抗原，又稱膜磷酸酯酶plcA，該抗原蛋白含512個氨基酸，是可能的相關毒力因子，該蛋白在所有的BCG(BCG-Danish，BCG-Prague，BCG-Glaxo，BCG-Frappier，BCG-Connauht，BCG-Phipps，BCG-Tice，BCG-Pateur，BCG-Moreau，BCG-Brikhaug，BCG-Sweden，BCG-Japan，BCG-Russian，BCG-Brazil)中均缺失，進一步通過生物信息學軟件對其進行抗原表位預測分析，發現Rv2351c蛋白存在較多的T細胞表位，具有潛在的診斷效能，并且Rv2351c只在結核分枝桿菌和少數環境分枝桿菌中存在，能有效區分結核病患者、肺部疾患病人和健康人，同時不受卡介苗接種的影響。結核的快速和早期診斷為結核病的早期治療提供了有力保證，但要想在源頭上遏制結核病還應從結核疫苗的制備方面入手。目前BCG疫苗是使用最廣泛的并且是唯一批準使用的結核疫苗，BCG對嬰幼兒腦膜炎有很好的保護效率，但是對成人結核保護率高低不一，目前對結核疫苗的改造主要分為兩方面：一是新型亞單位疫苗作為加強免疫疫苗，以增強BCG引起的免疫應答。二是將BCG缺失的免疫優勢抗原重新重組到BCG疫苗中通過過表達免疫優勢抗原，從而增強BCG引起的保護性免疫應答。BCG疫苗已使用多年，其安全性已經得到大量接種人群的驗證，因此以上兩種疫苗改造策略均建立在BCG的基礎上有很大的優勢。目前已有抗原如Ag85、Rv3425、HspX等多種免疫優勢抗原被鑒定并正在用于結核疫苗的研究中。由于結核分枝桿菌是胞內菌，在肺泡巨噬細胞中定植和增殖，細胞免疫應答在清除結核分枝桿菌中起到重要作用，研究也證實了體液免疫應答引起的抗體能改變結核分枝桿菌的病程發展，其中研究證實IgM、IgG1、IgG3和IgA等是保護性抗體，因此細胞免疫和體液免疫在結核感染中都至關重要。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2351c的應用。為了實現本專利技術目的，本專利技術提供結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2351c在制備結核病檢測試劑中的應用。其中，所述抗原蛋白Rv2351c的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。本專利技術還提供由所述抗原蛋白Rv2351c衍生的蛋白或其類似物。本專利技術還提供編碼所述抗原蛋白Rv2351c的DNA分子。本專利技術還提供含有所述DNA分子的表達載體、表達盒。本專利技術還提供含有所述DNA分子的轉基因細胞系。本專利技術還提供含有所述DNA分子的重組菌及其表達純化的重組蛋白。優選利用原核表達系統表達所述抗原蛋白Rv2351c，優選的原核表達載體為pET-30a載體，優選的原核細胞為大腸桿菌BL21(DE3)。在本專利技術的一個具體實施方案中，從結核分枝桿菌H37Rv基因組中擴增出Rv2351c的目的片段，目的片段膠回收后連接到T4載體上，轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中培養，提取質粒測序正確后，將質粒雙酶切連接到pET-30a載體上轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞中，37℃，IPTG誘導后得到包涵體蛋白，經純化復性后，得到有活性的Rv2351c蛋白。本專利技術還提供一種結核病檢測試劑，所述檢測試劑中含有結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2351c，或編碼所述抗原蛋白Rv2351c的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重組菌產生的重組蛋白。本專利技術還提供含有上述檢測試劑的結核ELISPOT檢測試劑盒。所述試劑盒中還包括：①一抗：抗人或動物IFN-γ的小鼠IgG單克隆抗體。②酶標試劑：辣根過氧化物酶標記的抗人或動物IFN-γ不同表位的另一種小鼠IgG單克隆抗體。③標準品：培養板：含有PVDF膜或硝酸纖維素膜的96孔微孔反應板，陽性對照孔中含有結核非特異性刺激抗原(如PHA等)，本地對照含有PBS或基底液。④其他ELISPOT檢測所需的試劑及耗材。優選地，一抗固定在上述微孔反應板上。本專利技術還提供結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2351c在制備結核疫苗中的應用。本專利技術還提供一種結核疫苗，其有效成分為結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2351c，或編碼所述抗原蛋白Rv2351c的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重組菌產生的重組蛋白。本專利技術還提供結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2351c在制備抗結核藥物中的應用。以結核本文檔來自技高網...
【技術保護點】
結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2351c在制備結核病檢測試劑中的應用；其中，所述抗原蛋白Rv2351c的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。
【技術特征摘要】
1.結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2351c在制備結核病檢測試劑中的應用；其中，所述抗原蛋白Rv2351c的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。2.一種結核病檢測試劑，其特征在于，所述檢測試劑中含有結核分枝桿菌抗原蛋白Rv2351c，或編碼所述抗原蛋白Rv2351c的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重組菌產生的重組蛋白。3.含有權利要求2所述檢測試劑的結核ELISPOT檢測試劑盒。4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括：①一抗：抗人或動物IFN-γ的小鼠IgG單克隆抗體；②酶標試劑：辣根過氧化物酶標記的抗人或動物IFN-γ不同表位的另一種小鼠IgG單克隆抗體；③標準品：培養板：含有PVDF膜或硝酸纖維素膜的96孔微孔反應板，陽性對照孔中含有結核非特異性刺激抗原，本地對照含有PBS；④其他ELISPOT檢測所需的試劑及耗材；優選地，一抗固定在上述微孔反應板上。5.結核分枝桿菌抗原蛋白R...
【專利技術屬性】
技術研發人員：萬康林，王雪枝，劉海燦，李馬超，蔣毅，
申請(專利權)人：中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，
類型：發明
國別省市：北京;11
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