一種富集及檢測(cè)微囊藻單細(xì)胞和群體生物量的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種富集及檢測(cè)微囊藻單細(xì)胞和群體生物量的方法，包括以下步驟：S01，富集：采用孔徑小于單細(xì)胞微囊藻直徑的浮游植物網(wǎng)過濾定量水體，得總藻液；S02，總微囊藻樣品的制備：取定量的所述總藻液，超聲；S03，單細(xì)胞微囊藻樣品的制備：另取定量的所述總藻液，過孔徑大于所述單細(xì)胞微囊藻直徑且小于10μm濾網(wǎng)；S04，檢測(cè)：分別取所述總微囊藻樣品和單細(xì)胞微囊藻樣品，通過流式細(xì)胞儀；S05，群體微囊藻生物量C3的計(jì)算。本發(fā)明專利技術(shù)提供的一種富集及檢測(cè)微囊藻單細(xì)胞和群體生物量的方法，能夠富集水體中單細(xì)胞和群體形態(tài)的微囊藻，通過流式細(xì)胞儀快速鑒別微囊藻，能夠反應(yīng)水體微囊藻生物量的動(dòng)態(tài)變化及其存在的形態(tài)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種富集及檢測(cè)微囊藻單細(xì)胞和群體生物量的方法，屬于資源環(huán)境

技術(shù)介紹
在湖泊水庫中，藍(lán)藻水華主要以微囊藻水華為主。微囊藻單細(xì)胞會(huì)在生長過程中形成群體。夏秋季生物量達(dá)到足夠濃度，并且微囊藻群體克服擾動(dòng)上升至水面，就會(huì)形成肉眼可見的水華現(xiàn)象。冬季微囊藻群體分散成單細(xì)胞和小群體形態(tài)，存活的單細(xì)胞和小群體形態(tài)的藻類則作為來年微囊藻水華的種源。為預(yù)測(cè)、了解和防治微囊藻水華現(xiàn)象，必須對(duì)全年微囊藻的生物量及在水體賦存形態(tài)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。通常，生物量的富集多采用64μm浮游植物網(wǎng)富集水體中的藻類，這樣會(huì)漏去單細(xì)胞及小群體形態(tài)的微囊藻。而通過過濾湖水富集藻細(xì)胞提取色素表征生物量的方法，會(huì)因不同環(huán)境下藻色素相對(duì)濃度不同，測(cè)量結(jié)果存在差異。因此，現(xiàn)有的檢索結(jié)果中不含單細(xì)胞及小群體形態(tài)的微囊藻的生物量，故檢測(cè)結(jié)果偏低，不能真實(shí)反應(yīng)水體中的微囊藻的生物量及其在水體中的賦存形態(tài)。所以目前缺少富集單細(xì)胞微囊藻的方法，而且目前在富集浮游藻類時(shí)會(huì)帶入泥沙顆粒，造成顯微鏡下計(jì)數(shù)和識(shí)別單細(xì)胞藻類比較困難。因而研發(fā)相應(yīng)的浮游植物網(wǎng)富集微囊藻細(xì)胞并建立測(cè)定其單細(xì)胞和群體生物量方法就顯得迫切需要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是，提供一種能夠富集單細(xì)胞微囊藻，并且可快速獲得單細(xì)胞微囊藻生物量和群體微囊藻生物量的方法，該法步驟簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)成本低，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確；進(jìn)一步地，本專利技術(shù)提供一種單細(xì)胞微囊藻分散效果好的富集及檢測(cè)微囊藻單細(xì)胞和群體生物量的方法。為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案為：一種富集及檢測(cè)微囊藻單細(xì)胞和群體生物量的方法，其特征在于，包括以下步驟：S01，富集：采用孔徑小于單細(xì)胞微囊藻直徑的浮游植物網(wǎng)過濾定量水體，得總藻液；S02，總微囊藻樣品的制備：取定量的所述總藻液，超聲，得總微囊藻樣品；S03，單細(xì)胞微囊藻樣品的制備：另取定量的所述總藻液，過孔徑大于所述單細(xì)胞微囊藻直徑且小于10μm濾網(wǎng)，濾液即為單細(xì)胞微囊藻樣品；S04，檢測(cè)：分別取所述總微囊藻樣品和單細(xì)胞微囊藻樣品，通過流式細(xì)胞儀，檢測(cè)，得總微囊藻生物量C1和單細(xì)胞微囊藻生物量C2；S05，群體微囊藻生物量C3的計(jì)算：C3＝C1-C2。所述浮游植物網(wǎng)的孔徑為3μm；所述浮游植物網(wǎng)的材質(zhì)為尼龍濾布。所述浮游植物網(wǎng)的制作方法為：將正方形的所述尼龍濾布相鄰兩邊折疊至少2次后縫合制成漏斗狀，頂端用鋼圈固定，下部裝配收集器。富集過程中，需反復(fù)沖洗所述浮游植物網(wǎng)的網(wǎng)衣外側(cè)，所述網(wǎng)衣內(nèi)部為所述總藻液。富集得到的所述總藻液，儲(chǔ)存在-4℃黑暗下，在24h內(nèi)通過所述流式細(xì)胞儀測(cè)定C1和C2。超聲條件為：在35HZ，45W條件下超聲0.5～1.5min。所述超聲條件為：在35HZ，45W條件下超聲1min。所述濾網(wǎng)的孔徑為10μm；所述濾網(wǎng)的材質(zhì)為紗絹。收集器為一個(gè)收集管，浮游植物網(wǎng)的底端設(shè)置有出液孔，出液孔與收集管的內(nèi)壁緊密相連，收集管是來收集藻液的，收集管上設(shè)置有開關(guān)，打開收集管的開關(guān)，藻液會(huì)流出來，然后裝到樣品管里。鋼圈是起支撐作用，支撐網(wǎng)衣不會(huì)發(fā)生變形。本專利技術(shù)的有益效果為：本專利技術(shù)能夠富集水體中單細(xì)胞和群體形態(tài)的微囊藻，獲得足夠藻濃度，并且經(jīng)過簡(jiǎn)單的預(yù)處理，通過流式細(xì)胞儀快速鑒別微囊藻，對(duì)單細(xì)胞微囊藻和群體微囊藻生物量準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，能夠反應(yīng)水體微囊藻生物量的動(dòng)態(tài)變化及其存在的形態(tài)。附圖說明圖1為本專利技術(shù)的富集及檢測(cè)流程圖；圖2為本專利技術(shù)超聲條件的優(yōu)化圖；圖3為本專利技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對(duì)本專利技術(shù)作更進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1：如圖1～圖3所示，一種富集及檢測(cè)微囊藻單細(xì)胞和群體生物量的方法，包括下列步驟：1.浮游植物網(wǎng)的制作及采樣：由于單細(xì)胞微囊藻粒徑在3～5μm，因此本實(shí)施例采用3μm的尼龍濾布，考慮到尼龍濾布網(wǎng)孔較細(xì)，盡量少剪裁，因此將濾布裁剪成正方形，將正方形相鄰兩邊折疊至少2次后用細(xì)布包裹縫制成漏斗狀，頂端用鋼圈固定，下部配收集器。制好的浮游植物網(wǎng)應(yīng)注意縫隙處不出現(xiàn)漏藻。2.浮游藻類的富集、轉(zhuǎn)移和保存：在水體中應(yīng)用浮游植物網(wǎng)富集藻類時(shí)，應(yīng)根據(jù)水體藻類豐度水平，用有機(jī)玻璃采水器定量采取水樣富集藻液，本實(shí)施例于2016年2月25日在太湖梅梁灣區(qū)域采集5L湖水進(jìn)行富集，初始富集時(shí)，在水壓的作用下，湖水快速透過浮游植物網(wǎng)。隨著壓力的減小和顆粒濃度增加，過濾狀態(tài)達(dá)到飽和，之后對(duì)浮游植物網(wǎng)外側(cè)進(jìn)行沖洗，當(dāng)過濾狀態(tài)再次達(dá)到飽和時(shí)，收集富集的藻液。樣品應(yīng)儲(chǔ)存在-4℃，黑暗下，生物量和生理特征的分析應(yīng)在24h內(nèi)完成測(cè)定。3.樣品的預(yù)處理及微囊藻單細(xì)胞和群體生物量的測(cè)定：采用35Hz，45W超聲功率，配置三組不同濃度的太湖微囊藻群體做超聲時(shí)間梯度試驗(yàn)1、2、3min，以確定水體微囊藻群體的最佳超聲時(shí)間。如圖2所示，0min是用水浴振蕩器在100℃下以120rad/min震蕩5min處理后鏡檢計(jì)數(shù)，1、2、3min是經(jīng)超聲處理后的樣品進(jìn)行鏡檢計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，在35Hz，45W，超聲1min，不同濃度的藻群體分散成單細(xì)胞效果最佳。流式細(xì)胞儀只能通過小于10μm的顆粒。需要將富集的藻樣取10mL經(jīng)超聲處理，將群體微囊藻分散成單細(xì)胞形態(tài)，獲得總微囊藻生物量。另取10mL藻樣過10μm紗絹，獲得單細(xì)胞藻類。由總微囊藻生物量減去單細(xì)胞微囊藻生物量可以得到群體微囊藻生物量。流式細(xì)胞儀分析：采用美國貝克曼公司的cytoflex型號(hào)的流式細(xì)胞儀。依據(jù)葉綠素FL3(690/50nm)和藻藍(lán)素FL4(660/20nm)熒光通道鑒別微囊藻。樣品檢測(cè)時(shí)間范圍3-7min。如圖3所示，流式細(xì)胞儀根據(jù)藻藍(lán)素和葉綠素的熒光差異區(qū)分不同藻類并計(jì)數(shù)，而微囊藻的藻藍(lán)素?zé)晒庑盘?hào)要高于其他細(xì)胞群，易于識(shí)別。實(shí)施例2：如圖1～圖3所示，一種富集及檢測(cè)微囊藻單細(xì)胞和群體生物量的方法，包括下列步驟：1.浮游植物網(wǎng)的制作及采樣：由于單細(xì)胞微囊藻粒徑在3～5μm，因此本實(shí)施例采用2.5μm的尼龍濾布，考慮到尼龍濾布網(wǎng)孔較細(xì)，盡量少剪裁，因此將濾布裁剪成正方形，將正方形相鄰兩邊折疊2次后用細(xì)布包裹縫制成漏斗狀，頂端用鋼圈固定，下部配收集器。制好的浮游植物網(wǎng)應(yīng)注意縫隙處不出現(xiàn)漏藻。2.浮游藻類的富集、轉(zhuǎn)移和保存：在水體中應(yīng)用浮游植物網(wǎng)富集藻類時(shí)，應(yīng)根據(jù)水體藻類豐度水平，用有機(jī)玻璃采水器定量采取水樣富集藻液，本實(shí)施例于2016年2月25日在太湖梅梁灣區(qū)域采集5L湖水進(jìn)行富集，初始富集時(shí)，在水壓的作用下，湖水快速透過浮游植物網(wǎng)。隨著壓力的減小和顆粒濃度增加，過濾狀態(tài)達(dá)到飽和，之后對(duì)浮游植物網(wǎng)外側(cè)進(jìn)行沖洗，當(dāng)過濾狀態(tài)再次達(dá)到飽和時(shí)，再次對(duì)浮游植物網(wǎng)外側(cè)進(jìn)行沖洗，當(dāng)濾狀態(tài)第三次達(dá)到飽和時(shí)，收集富集的藻液，得總藻液。總藻液樣品應(yīng)儲(chǔ)存在-4℃，黑暗下，生物量和生理特征的分析應(yīng)在24h內(nèi)完成測(cè)定。3.樣品的預(yù)處理及微囊藻單細(xì)胞和群體生物量的測(cè)定：流式細(xì)胞儀只能通過小于10μm的顆粒。需要將富集的總藻液取10mL經(jīng)超聲處理，超聲條件為采用35Hz，45W超聲功率，超聲0.5min，將群體微囊藻分散成單細(xì)胞形態(tài)，獲得總微囊藻生物量。另取10mL總藻液過10μm紗絹，獲得單細(xì)胞微囊藻類。由總微囊藻生物量減去單細(xì)胞微囊藻生物量可以得到群體微囊藻生物量。流式細(xì)胞儀分析：采用美國貝克曼公司的cytoflex型號(hào)的流式細(xì)胞儀。依據(jù)葉本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種富集及檢測(cè)微囊藻單細(xì)胞和群體生物量的方法，其特征在于，包括以下步驟：S01，富集：采用孔徑小于單細(xì)胞微囊藻直徑的浮游植物網(wǎng)過濾定量水體，得總藻液；S02，總微囊藻樣品的制備：取定量的所述總藻液，超聲，得總微囊藻樣品；S03，單細(xì)胞微囊藻樣品的制備：另取定量的所述總藻液，過孔徑大于所述單細(xì)胞微囊藻直徑且小于10μm濾網(wǎng)，濾液即為單細(xì)胞微囊藻樣品；S04，檢測(cè)：分別取所述總微囊藻樣品和單細(xì)胞微囊藻樣品，通過流式細(xì)胞儀，檢測(cè)，得總微囊藻生物量C1和單細(xì)胞微囊藻生物量C2；S05，群體微囊藻生物量C3的計(jì)算：C3＝C1?C2。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種富集及檢測(cè)微囊藻單細(xì)胞和群體生物量的方法，其特征在于，包括以下步驟：S01，富集：采用孔徑小于單細(xì)胞微囊藻直徑的浮游植物網(wǎng)過濾定量水體，得總藻液；S02，總微囊藻樣品的制備：取定量的所述總藻液，超聲，得總微囊藻樣品；S03，單細(xì)胞微囊藻樣品的制備：另取定量的所述總藻液，過孔徑大于所述單細(xì)胞微囊藻直徑且小于10μm濾網(wǎng)，濾液即為單細(xì)胞微囊藻樣品；S04，檢測(cè)：分別取所述總微囊藻樣品和單細(xì)胞微囊藻樣品，通過流式細(xì)胞儀，檢測(cè)，得總微囊藻生物量C1和單細(xì)胞微囊藻生物量C2；S05，群體微囊藻生物量C3的計(jì)算：C3＝C1-C2。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種富集及檢測(cè)微囊藻單細(xì)胞和群體生物量的方法，其特征在于：所述浮游植物網(wǎng)的孔徑為3μm；所述浮游植物網(wǎng)的材質(zhì)為尼龍濾布。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種富集及檢測(cè)微囊藻單細(xì)胞和群體生物量的方法，其特征在于：所述浮游植物網(wǎng)的制作方法為：將正方形的所述尼龍濾布相鄰...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：朱偉，周小華，陳懷民，吳思麟，趙鴻茹，徐鋒，陳程，譚嘯，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：河海大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32