本發明專利技術公開了一種植物內生菌16S?rRNA基因擴增方法及應用，其擴增步驟包括植物預處理、植物樣本總DNA提取、樣本16S?rRNA基因的擴增和基于Illumina平臺的高通量測序及生物信息分析，樣本16S?rRNA基因的擴增包括16S?rRNA基因全長的乳液PCR擴增和16S?rRNA基因高變區/保守區擴增子擴增，基于Illumina平臺的高通量測序及生物信息分析包括植物內生細菌16S?rRNA基因擴增子純化回收、擴增子測序文庫構建、Illumina?HiSeq測序和測序數據生物信息學分析。該基因擴增方法用于高通量測序的植物病害檢測及植食性動物腸道微生物檢測。本發明專利技術采用高通量測序技術進行植物內生細菌的測序分析，數據量更大，檢測結果更完整，而且最大程度降低了植物宿主的污染，結果多樣性更高，而且成本低。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因擴增
，具體是一種植物內生菌16SrRNA基因擴增方法及應用。
技術介紹
植物內生菌是植物微生態系統中的重要組成部分，在長期協同進化過程中其與植物形成了相互依存的關系。植物內生菌可以產生活性物質作為生物紡織資源、外源基因的載體和新藥的來源，在農業、醫藥衛生領域有著巨大的應用前景。雖然經過多年的研究，但目前植物內生細菌的研究還是處于初級階段，對于植物內生細菌在植物中的分布及豐度調查還依賴于傳統的分離純化后使用通量較低的DGGE等方法，即使采用高通量測序進行的相關研究也因為植物宿主本身的質體和線粒體的干擾，造成植物內生細菌的研究始終處在基礎研究的水平。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服植物內生細菌傳統研究方法中需培養分離和植物宿主基因干擾等技術局限，提供一種植物內生菌16SrRNA基因擴增方法及應用，以解決上述
技術介紹
中提出的問題。為實現上述目的，本專利技術提供如下技術方案：一種植物內生菌16SrRNA基因擴增方法，具體步驟如下：(1)植物預處理：取植物樣本0.5-1g，經超聲清洗后在超凈臺中使用有效率濃度2％的次氯酸鈉溶液浸泡消毒4-6min，使用無菌水沖洗一遍后使用體積百分比為70-75％的乙醇溶液浸泡25-35s，隨后使用無菌水沖洗3-5遍徹底去除樣本表面消毒劑；(2)植物樣本總DNA提取：通過表面消毒的樣本經液氮研磨均勻后轉至1.5ml離心管中，通過CTAB法純化樣本總DNA；(3)樣本16SrRNA基因的擴增：包括16SrRNA基因全長的乳液PCR擴增和16SrRNA基因高變區/保守區擴增子擴增；31)16SrRNA基因全長的乳液PCR擴增①設計三對引物AP1429(F/R)，MTR(F/R)和CHP(F/R)均以原核生物和植物16SrRNA基因為模板，其中MTR(F/R)和CHP(F/R)引物3’末端以C3spacer或C5spacer修飾，紅色標記堿基為鎖核酸修飾基團，用于抑制植物宿主來源的污染，AP1429(F/R)引物對用于植物內生細菌16SrRNA基因的擴增；②配置植物內生細菌16SrRNA基因的乳液PCR混合液，該混合液由乳液發生劑和PCR擴增緩沖液構成；③將步驟②用于擴增植物內生細菌16SrRNA基因的乳液PCR混合液移入0.2mLPCR管中并置于帶有熱蓋功能的PCR儀中，在PCR以上運行以下反應循環：95℃1min，1個循環；98℃5s，68-70℃1min，55℃30s，68-72℃1min，25個循環；68-72℃5min，1個循環；25℃恒溫；④向步驟③每個PCR管的反應產物中添加10％體積的2-丁醇，震蕩混勻后以13200×g離心4-6min，離心完成后取下層水相溶液為模板進行16SrRNA基因高變區/保守區擴增子擴增，結果檢測通過吸取5μL反應產物，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，以不加MTR(F/R)和CHP(F/R)引物對的PCR產物作為陽性對照，回收目的條帶；32)16SrRNA基因高變區/保守區擴增子擴增：以31)中的④步驟水相反應產物為模板，使用引物U515F:5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和E806R:5’-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3’在PCR擴增緩沖液中，在95℃1min，1個循環；98℃5s，55℃30s，68-72℃30s，20個循環；68-72℃5min，1個循環；25℃恒溫的PCR循環條件下完成，結果通過吸取該步驟反應產物5μL在瓊脂糖凝膠電泳中檢測；(4)基于Illumina平臺的高通量測序及生物信息分析：包括植物內生細菌16SrRNA基因擴增子純化回收、擴增子測序文庫構建、IlluminaHiSeq測序和測序數據生物信息學分析；41)植物內生細菌16SrRNA基因擴增子純化回收將步驟32)的反應產物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用QIAquick凝膠回收試劑盒切膠回收片段大小在280-300bp之間的目標條帶，TE緩沖液洗脫回收目標DNA片段；使用2％瓊脂糖電泳檢測，檢測條件5V/cm，20min；42)擴增子測序文庫構建文庫構建使用Illumina公司TruSeqDNAPCR-FreeSamplePrepKit；43)IlluminaHiSeq測序測序平臺為IlluminaHiSeq2500，測序模式為V2SBS快速250PE模式；44)測序數據生物信息學分析測序得到的PEreads用FLASH軟件進行拼接，同時對序列質量進行質控，在去除低質量堿基及接頭污染序列操作過程后完成數據過濾，得到供后續分析的高質量目標序列，后續生物信息學操作使用QIIME、Usearch或Mothur完成，統計和作圖使用R完成，操作步驟如下：a、根據Barcode區分樣品；b、使用Uchime去除嵌合體；c、在97％的相似性水平上使用UPARSE算法進行OTU的聚類；d、挑選出OTU的代表性序列；e、使用Greengene或Silva數據庫進行物種分類信息的劃分。作為本專利技術進一步的方案：所述步驟31)的步驟②中，所述乳液發生劑由含有質量分數為94.9％礦物油、4.5％Span80、0.5％吐溫80、0.1％TritonX-100構成，所述PCR擴增緩沖液由0.4μM引物、2.5mM氯化鎂、0.2mMdNTPs、1UTaqDNA聚合酶以及DNA模板組成。作為本專利技術再進一步的方案：所述步驟32)中的PCR擴增緩沖液由40mMTris-HClpH8.0、40mMKCl、3mMMgCl2、5％甘油、1％吐溫20、1mMdNTPs、1個單位的KODDNA聚合酶、10μMU515F、10μME806R和1μL的31)步驟④水相反應產物構成。一種所述的植物內生菌16SrRNA基因擴增方法的應用，該基因擴增方法用于高通量測序的植物病害檢測及植食性動物腸道微生物檢測。與現有技術相比，本專利技術的有益效果是：1、本專利技術采用高通量測序技術進行植物內生細菌的測序分析，相較于傳統的DGGE等方法數據量更大，檢測結果更完整；2、本專利技術采用的植物內生菌測序技術最大程度降低了植物宿主的污染，對于植物內生細菌的研究帶來了其他常規方法不能達到的精度和準確度；3、本專利技術采用的植物內生細菌測序技術相較于目前采用roche454測序平臺進行的測序，結果顯示本專利技術的結果多樣性更高，成本低于roche454測序平臺的十分之一。附圖說明圖1為植物內生細菌16SrRNA基因擴增結果示意圖。M：DNA分子量標記；C：對照擴增結果；R：植物內生細菌擴增結果。圖2為門水平植物內生細菌群落結構高通量測序結果示意圖。GSS：本專利技術植物內生細菌樣本；C：對照植物內生細菌樣本具體實施方式下面將結合本專利技術實施例中的附圖，對本專利技術實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本專利技術一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本專利技術中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本專利技術保護的范圍。植物內生菌16SrRNA基因擴增方法如下：(1)植物預處理：取植物樣本0.5-1g，經超聲清洗后在超凈臺中使用有效率濃度2％的次氯酸鈉溶液浸泡消毒5min，使用無菌水沖洗一遍后使用體積百分比為75％的乙醇溶液浸本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種植物內生菌16S?rRNA基因擴增方法，其特征在于，具體步驟如下：(1)植物預處理：取植物樣本0.5?1g，經超聲清洗后在超凈臺中使用有效率濃度2％的次氯酸鈉溶液浸泡消毒4?6min，使用無菌水沖洗一遍后使用體積百分比為70?75％的乙醇溶液浸泡25?35s，隨后使用無菌水沖洗3?5遍徹底去除樣本表面消毒劑；(2)植物樣本總DNA提取：通過表面消毒的樣本經液氮研磨均勻后轉至1.5ml離心管中，通過CTAB法純化樣本總DNA；(3)樣本16S?rRNA基因的擴增：包括16S?rRNA基因全長的乳液PCR擴增和16S?rRNA基因高變區/保守區擴增子擴增；31)16S?rRNA基因全長的乳液PCR擴增①設計三對引物AP1429/F?R，MTR/F?R和CHP/F?R均以原核生物和植物16S?rRNA基因為模板，其中MTR/F?R和CHP/F?R引物3’末端以C3spacer或C5spacer修飾，紅色標記堿基為鎖核酸修飾基團，用于抑制植物宿主來源的污染，AP1429/F?R引物對用于植物內生細菌16S?rRNA基因的擴增；②配置植物內生細菌16S?rRNA基因的乳液PCR混合液，該混合液由體積為1:1的乳液發生劑和PCR擴增緩沖液混合而成。③將步驟②用于擴增植物內生細菌16S?rRNA基因的乳液PCR混合液移入0.2mL?PCR管中并置于帶有熱蓋功能的PCR儀中，在PCR以上運行以下反應循環：95℃1min，1個循環；98℃5s，68?70℃1min，55℃30s，68?72℃1min，25個循環；68?72℃5min，1個循環；25℃恒溫；④向步驟③每個PCR管的反應產物中添加10％體積的2?丁醇，震蕩混勻后以13200×g離心4?6min，離心完成后取下層水相溶液為模板進行16S?rRNA基因高變區/保守區擴增子擴增，結果檢測通過吸取5μL反應產物，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，以不加MTR(F/R)和CHP(F/R)引物對的PCR產物作為陽性對照，回收目的條帶；32)16S?rRNA基因高變區/保守區擴增子擴增：以31)中的④步驟水相反應產物為模板，使用引物U515F:5’?GTGCCAGCMGCCGCGGTAA?3’和E806R:5’?GGACTACCAGGGTATCTAAT?3’在PCR擴增緩沖液中，在95℃1min，1個循環；98℃5s，55℃30s，68?72℃30s，20個循環；68?72℃5min，1個循環；25℃恒溫的PCR循環條件下完成，結果通過吸取該步驟反應產物5μL在瓊脂糖凝膠電泳中檢測；(4)基于Illumina平臺的高通量測序及生物信息分析：包括植物內生細菌16S?rRNA基因擴增子純化回收、擴增子測序文庫構建、Illumina?HiSeq測序和測序數據生物信息學分析；41)植物內生細菌16S?rRNA基因擴增子純化回收將步驟32)的反應產物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用QIAquick凝膠回收試劑盒切膠回收片段大小在280?300bp之間的目標條帶，TE緩沖液洗脫回收目標DNA片段；使用2％瓊脂糖電泳檢測，檢測條件5V/cm，20min；42)擴增子測序文庫構建文庫構建使用Illumina公司TruSeq?DNA?PCR?Free?Sample?Prep?Kit；43)Illumina?HiSeq測序測序平臺為Illumina?HiSeq?2500，測序模式為V2?SBS快速250PE模式；44)測序數據生物信息學分析測序得到的PE?reads用FLASH軟件進行拼接，同時對序列質量進行質控，在去除低質量堿基及接頭污染序列操作過程后完成數據過濾，得到供后續分析的高質量目標序列，后續生物信息學操作使用QIIME、Usearch或Mothur完成，統計和作圖使用R完成，操作步驟如下：a、根據Barcode區分樣品；b、使用Uchime去除嵌合體；c、在97％的相似性水平上使用UPARSE算法進行OTU的聚類；d、挑選出OTU的代表性序列；e、使用Greengene或Silva數據庫進行物種分類信息的劃分。...
【技術特征摘要】
1.一種植物內生菌16SrRNA基因擴增方法，其特征在于，具體步驟如下：(1)植物預處理：取植物樣本0.5-1g，經超聲清洗后在超凈臺中使用有效率濃度2％的次氯酸鈉溶液浸泡消毒4-6min，使用無菌水沖洗一遍后使用體積百分比為70-75％的乙醇溶液浸泡25-35s，隨后使用無菌水沖洗3-5遍徹底去除樣本表面消毒劑；(2)植物樣本總DNA提取：通過表面消毒的樣本經液氮研磨均勻后轉至1.5ml離心管中，通過CTAB法純化樣本總DNA；(3)樣本16SrRNA基因的擴增：包括16SrRNA基因全長的乳液PCR擴增和16SrRNA基因高變區/保守區擴增子擴增；31)16SrRNA基因全長的乳液PCR擴增①設計三對引物AP1429/F-R，MTR/F-R和CHP/F-R均以原核生物和植物16SrRNA基因為模板，其中MTR/F-R和CHP/F-R引物3’末端以C3spacer或C5spacer修飾，紅色標記堿基為鎖核酸修飾基團，用于抑制植物宿主來源的污染，AP1429/F-R引物對用于植物內生細菌16SrRNA基因的擴增；②配置植物內生細菌16SrRNA基因的乳液PCR混合液，該混合液由體積為1:1的乳液發生劑和PCR擴增緩沖液混合而成。③將步驟②用于擴增植物內生細菌16SrRNA基因的乳液PCR混合液移入0.2mLPCR管中并置于帶有熱蓋功能的PCR儀中，在PCR以上運行以下反應循環：95℃1min，1個循環；98℃5s，68-70℃1min，55℃30s，68-72℃1min，25個循環；68-72℃5min，1個循環；25℃恒溫；④向步驟③每個PCR管的反應產物中添加10％體積的2-丁醇，震蕩混勻后以13200×g離心4-6min，離心完成后取下層水相溶液為模板進行16SrRNA基因高變區/保守區擴增子擴增，結果檢測通過吸取5μL反應產物，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，以不加MTR(F/R)和CHP(F/R)引物對的PCR產物作為陽性對照，回收目的條帶；32)16SrRNA基因高變區/保守區擴增子擴增：以31)中的④步驟水相反應產物為模板，使用引物U515F:5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和E806R:5’-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3’在PCR擴增緩沖液中，在95℃1min，1個循環；98℃5s，55℃30s，68-72℃30s，20個循環；68-72℃5min，1個循環；25℃恒溫的PCR循環條件下完成，結果通...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張時恒，孫梓健，安家興，劉馳，涂波，
申請(專利權)人：成都羅寧生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：四川;51
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