一種蛋白純化用磁珠的制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種蛋白純化用磁珠的制備方法。以殼聚糖和磁粉為原料，在交聯(lián)劑作用下形成交聯(lián)殼聚糖包覆磁粉的核殼結(jié)構(gòu)顆粒，經(jīng)還原和羧甲基化作用形成蛋白純化用磁珠。將該蛋白純化用磁珠用于帶有his?tag的蛋白質(zhì)的分離純化，極大提高分離效率。本發(fā)明專利技術(shù)避免了洗脫時可能出現(xiàn)的蛋白質(zhì)變性的問題，且能提高蛋白質(zhì)的分離效率。同時，操作便捷，適用于渾濁蛋白溶液的分離，尤其適用于大工業(yè)生產(chǎn)。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物
，具體涉及一種應用于蛋白質(zhì)分離純化的磁珠的制備方法。
技術(shù)介紹
蛋白質(zhì)的分離純化主要有鹽析、離心、凝膠電泳和親和層析等方法。其中，鹽析、離心和凝膠電泳受限于成本高和效率低等因素，應用比較局限。親和層析是將具有特殊結(jié)構(gòu)的親和分子制成固相吸附劑放置在層析柱中，當要被分離的蛋白混合液通過層析柱時，與吸附劑具有親和能力的蛋白質(zhì)就會被吸附而滯留在層析柱中，經(jīng)洗脫即可分離純化。目前，對于重組蛋白的分離純化，金屬螯合親和層析是最常應用的技術(shù)手段。金屬螯合親和層析是利用蛋白質(zhì)表面的一些氨基酸如組氨酸、色氨酸和半胱氨酸等能與金屬離子發(fā)生特異性吸附，從而對蛋白質(zhì)進行分離的技術(shù)。其中的His-tag技術(shù)，就是以4-10個組氨酸標記要分離的目標蛋白質(zhì)，組氨酸殘基帶有1個咪唑基團，能夠與Ni2+、Co2+、Cu2+金屬離子螯合從而特異吸附到介質(zhì)上實現(xiàn)分離。常規(guī)的金屬螯合親和層析介質(zhì)大多是葡聚糖和瓊脂糖，但這兩種層析介質(zhì)制備復雜，價格昂貴，且不耐壓，一般僅適合實驗室使用。作為葡聚糖和瓊脂糖基質(zhì)的替代者，殼聚糖有很多優(yōu)勢，如資源豐富價格低，生物相容性好，配基偶聯(lián)方法簡單，非特異性吸附弱等。殼聚糖是一種天然的堿性多糖，C2位帶有氨基，C3和C6位帶有羥基，可與各種含有醛基的交聯(lián)劑反應，因此易于衍生化。目前，對于殼聚糖應用的開發(fā)主要集中于廢水處理領(lǐng)域。CN201010610928.3于2011年7月27日公開了一種磁性殼聚糖微球的制備方法，將殼聚糖，含F(xiàn)e3+，F(xiàn)e2+的溶液在酸性條件下混合，然后將該混合液滴加到堿性溶液中進行沉淀反應，所得沉淀物即為磁性殼聚糖微球。該專利技術(shù)制得的磁性殼聚糖微球，分布在表層，且對殼聚糖并未采用交聯(lián)劑增強機械強度，承壓力較差，不適用于蛋白質(zhì)的分離純化，僅適合于污水處理或者用于作為藥物載體。CN201510622284.2于2015年12月23日公開了一種糠醛改性交聯(lián)殼聚糖螯合樹脂磁性顆粒的制備方法，其步驟為：1、以糠醛為原料，殼聚糖為基質(zhì)，制備糠醛改性殼聚糖；2、使用戊二醛為交聯(lián)劑，將糠醛改性殼聚糖進行交聯(lián)，并將其包覆在顆粒表面，得到糠醛改性交聯(lián)殼聚糖螯合樹脂磁性顆粒。該專利技術(shù)采用糠醛對殼聚糖進行改性，是為了引入更多的N原子和O原子，增加樹脂中可以與金屬離子配對的原子數(shù)量。這種處理辦法對于處理工業(yè)廢水污染中重金屬離子的回收吸附比較有效，但在金屬螯合親和層析中金屬離子過多反而導致蛋白質(zhì)變性，因此不適用。CN201310257075.3于2013年10月9日公開了一種一種咪唑和殼聚糖功能化磁性粒子及其制備方法，由磁粉、油酸、殼聚糖和咪唑等反應制得，用于去除工業(yè)廢水中磺酸染料。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種適用于工業(yè)化應用的蛋白質(zhì)大規(guī)模分離純化的磁性殼聚糖介質(zhì)的制備方法。由于葡聚糖和瓊脂糖樹脂的機械強度低不耐壓，以及制備工藝復雜、價格昂貴等特點，使得這兩種介質(zhì)不適用于蛋白質(zhì)的大規(guī)模純化。同時，普通的交聯(lián)殼聚糖也存在裝填較大的層析柱時會擠壓變形的問題。為解決上述問題，本專利技術(shù)提供一種蛋白純化用磁珠的制備方法。該磁珠是將殼聚糖交聯(lián)在磁粉表面，避免了普通殼聚糖樹脂的擠壓變形問題；顆粒內(nèi)部無螯合金屬離子也避免了因此而帶來的問題；同時顆粒帶有磁感應性，可以在磁場作用下從溶液中快速分離，便于雜蛋白的清洗與純蛋白的洗脫操作，尤其適用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。本專利技術(shù)的技術(shù)方案本專利技術(shù)提供一種蛋白純化用磁珠的制備方法，是在磁珠表面構(gòu)建羧甲基化的交聯(lián)殼聚糖包膜；所述羧甲基化交聯(lián)殼聚糖的結(jié)構(gòu)如下：本專利技術(shù)提供的蛋白純化用磁珠的制備方法，其過程為：1、取殼聚糖、純水、冰醋酸，充分溶解，得殼聚糖溶液；所述殼聚糖溶液中殼聚糖的質(zhì)量百分比濃度為0.1%-2%；2、取步驟1所制殼聚糖溶液，加入磁粉，攪拌混勻，加入交聯(lián)劑，加入堿性溶液調(diào)節(jié)PH值至5.5-9.5，此時能發(fā)生醛胺縮合反應，產(chǎn)生交聯(lián)殼聚糖；3、在攪拌條件下加入NaBH4，還原亞胺而形成穩(wěn)定交聯(lián)結(jié)構(gòu)；4、充分洗滌后，往反應體系中加入氯乙酸鈉，控制溫度為80-95℃，PH值為8-9，攪拌，此時產(chǎn)生羧甲基化反應，形成可螯合金屬離子的交聯(lián)殼聚糖，即蛋白純化用磁珠；將所得蛋白純化用磁珠加入螯合金屬離子溶液中，攪拌混勻，加入帶有His-tag的目標蛋白混合液，經(jīng)反應，目標蛋白特異結(jié)合在蛋白純化用磁珠上，采用磁性吸附的方式將所述蛋白純化用磁珠分離出來，經(jīng)緩沖液洗雜和咪唑溶液洗脫，即得純化后的目標蛋白。步驟2中所述磁粉其規(guī)格為300-1200目；所述交聯(lián)劑為乙二醛或者戊二醛。本專利技術(shù)所述蛋白純化用磁珠其改性交聯(lián)殼聚糖的實現(xiàn)過程可用反應式表示如下：有益效果針對葡聚糖、瓊脂糖和普通交聯(lián)殼聚糖在蛋白質(zhì)大規(guī)模純化方面的不足，本專利技術(shù)采用以磁粉為內(nèi)核，以改性交聯(lián)殼聚糖為外殼的核殼結(jié)構(gòu)的磁珠，具有多方面的優(yōu)點，其一是顆粒內(nèi)部為實心結(jié)構(gòu)，避免了大量的內(nèi)部螯合金屬離子洗脫導致洗脫液中Ni2+和Cu2+等金屬離子過多而使目標蛋白變性；其二，由于蛋白純化用磁珠具有磁感應性，在分離時，在磁場的作用下可以快速分離，易于操作；最后，由于磁場分離的便捷，渾濁的細胞破碎液無需繁瑣費事的離心或過濾處理，而直接用于純化操作，特別適合于大規(guī)模生產(chǎn)。具體實施方式下面通過具體實施例對本專利技術(shù)做進一步的闡述。以下實施例中的磁粉規(guī)格為600目，購自靈壽縣宇通礦產(chǎn)品加工廠；殼聚糖脫乙酰度為95%，購自桓臺縣金湖甲殼制品有限公司。實施例1（1）取殼聚糖9g，加純水900ml，攪拌下加入3ml冰醋酸，充分攪拌溶解，冷卻至4℃，制得殼聚糖溶液；（2）在10L的反應體系中，加入磁粉750g、蒸餾水1875ml，加入步驟（1）中所制的殼聚糖溶液750ml，在高速攪拌條件下加入冷的4%的乙二醛溶液37.5ml，充分混勻；（3）加入0.2mol/L的K2HPO4溶液220ml，高速攪拌2h；（4）加入（NH4）2SO440g，同時以1mol/L的NaOH溶液動態(tài)調(diào)節(jié)并維持溶液的pH為8.5左右，攪拌2h；（5）加入NaBH410g，攪拌2h，去除上清液，用5L蒸餾水洗滌2次；（6）加入氯乙酸鈉66g，在85℃，PH8.5的條件下，攪拌2h；（7）經(jīng)以上步驟得到的混合物，用蒸餾水洗滌2次，即得到蛋白純化用磁珠。取上述蛋白純化用磁珠0.3g（濕），加入0.1mol/l的NiSO41ml，混勻10min，磁吸去上清，用緩沖液（含0.5mol/LNaCl，20mmol/L磷酸鹽，PH7.4）洗滌3次（1ml*3），加入含有6His標記的青霉素酰化酶的大腸桿菌細胞破碎液，在4℃恒溫混合10min。磁吸去上清，以1ml0.5mol/LNaCl溶液（含20mmol/L磷酸鹽，PH7.4）洗滌3次去除雜質(zhì)，最后加洗脫液（含0.5mol/LNaCl和0.5mol/L咪唑，PH7.4）洗脫三次（0.5ml*3），合并洗脫液，得到純化青霉素酰化酶。將洗脫液進行SDS-PAGE電泳，得到目標蛋白的純度約為95%。實施例2mol/L（1）取殼聚糖9g，加純水900ml，攪拌下加入3ml冰醋酸，充分攪拌溶解，冷至4℃，制得殼聚糖溶液；（2）在10L的反應體系中，加入磁粉750g、蒸餾水1875ml，加入步驟一中所制的殼聚糖溶液750ml，在高速本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種蛋白純化用磁珠的制備方法，其特征為所述蛋白純化用磁珠是外殼為改性交聯(lián)殼聚糖內(nèi)核為磁粉的核殼結(jié)構(gòu)，所述改性交聯(lián)殼聚糖的具體結(jié)構(gòu)為：。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種蛋白純化用磁珠的制備方法，其特征為所述蛋白純化用磁珠是外殼為改性交聯(lián)殼聚糖內(nèi)核為磁粉的核殼結(jié)構(gòu)，所述改性交聯(lián)殼聚糖的具體結(jié)構(gòu)為：。2.如權(quán)利要求1所述的蛋白純化用磁珠的制備方法，其特征是過程為：（1）、取殼聚糖、純水、冰醋酸，充分溶解，得殼聚糖溶液；所述殼聚糖溶液中殼聚糖的質(zhì)量百分比濃度為0.1%-2%；（2）、取步驟（1）所制...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：金彩科，鄭誠，
申請(專利權(quán))人：深圳市紅莓生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東;44