長鏈非編碼LINC01420的siRNA的應用及抑制制劑制造技術

本發明專利技術公開了長鏈非編碼LINC01420的siRNA的應用及抑制制劑。通過設計并合成靶向LINC01420的siRNA序列，轉染到鼻咽癌細胞株中，證實靶向干擾LINC01420的表達可明顯抑制鼻咽癌細胞的侵襲能力。本發明專利技術為鼻咽癌的治療提供了新的潛在的途徑。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于腫瘤分子生物學領域，具體涉及長鏈非編碼LINC01420的siRNA的應用及抑制制劑。
技術介紹
人類基因組計劃及其后續的DNA元件百科全書計劃(TheEncyclopediaofDNAElementsProject,ENCODE)研究成果表明，蛋白編碼基因序列僅占人類基因組序列的1-3％，而人基因組中絕大部分可轉錄的序列為長鏈非編碼RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA)。LncRNA廣泛地存在于各種生物中，且隨著生物復雜程度的升高，基因組中lncRNA序列的比例也相應地增大，提示lncRNA在生物進化過程中有重要意義。隨著lncRNA不斷被發現，它們的功能逐漸被詮釋，科學家們發現lncRNA廣泛而活躍地參與到生命活動不同層面的功能調控中，作為一個嶄新的領域，已經成為國際生命科學研究領域新的前沿與熱點。LncRNA可作為功能蛋白質的信號(signal)、誘導(guide)、誘餌(decoy)或支架(scaffold)分子等多種方式，在染色質重構、基因轉錄、翻譯及蛋白修飾等多重水平調控基因的表達，并在包括發育、免疫、生殖等基本生理過程中扮演了不可替代的角色，更重要的是，lncRNA的表達與功能失調已經與包括惡性腫瘤在內的人類多種疾病緊密聯系在了一起。因此，深入研究lncRNA的功能，揭示由lncRNA介導的遺傳信息傳遞方式和表達調控網絡，不僅可以從蛋白編碼基因以外的角度重新注釋和闡明基因組的結構與功能，深入發現生命活動的本質和規律，還有望從一個新的視角認識包括腫瘤在內的多種人類常見疾病的發病機理，并為這些疾病的診斷與治療提供新的分子標志物與治療靶點。鼻咽癌是常見高發的頭頸部惡性腫瘤，容易發生頸部淋巴結轉移，預后較差。研究表明，這種腫瘤的發生發展是多基因參與、多步驟、多階段的復雜過程，LncRNA在鼻咽癌的發生發展過程中可能也起到了重要的作用。最近我們發現lncRNALINC01420(NCBIaccessionnumber:NR_015367)在鼻咽癌組織中表達上調，針對該lncRNA的檢測制劑也可以用于鼻咽癌的輔助診斷。我們進一步增加樣本，在110例有臨床隨訪資料的鼻咽癌石蠟存檔標本中，通過原位雜交(insituhybridization)的方法檢測了LINC01420的表達水平，發現LINC01420在鼻咽癌組織中表達上調，高表達LINC01420的鼻咽癌患者比低表達LINC01420的鼻咽癌患者預后差，因此針對該lncRNA的檢測制劑也可以用于鼻咽癌的預后判斷。我們通過設計并合成靶向LINC01420的siRNA序列，轉染到鼻咽癌細胞株中，在體外培養系統證實靶向干擾LINC01420的表達可明顯抑制鼻咽癌細胞的侵襲與轉移能力。
技術實現思路
針對上述現有技術，本專利技術的目的是提供長鏈非編碼LINC01420的siRNA的應用及抑制制劑。長鏈非編碼LINC01420的siRNA的應用，利用長鏈非編碼LINC01420的siRNA構建抑制鼻咽癌侵襲與轉移的制劑，該長鏈非編碼RNALINC01420的序列如SEQNO:1所示。長鏈非編碼LINC01420的siRNA序列為以下三條中的一條或幾條：siRNA-1：5'-CAUCUCAGGUCUCUUGGCUUUGCCA-3'，siRNA-2：5'-GCGUUGGGAUUAUCCGGAAGGAACU-3'siRNA-3：5'-CCUCUGAGAUUUAAGGCCAUGCCCU-3'。所述的抑制鼻咽癌侵襲與轉移的制劑還包括陰性對照Scramble序列：5’-GACACGCGACUUGUACCAC-3’。本專利技術公開了長鏈非編碼LINC01420的siRNA的應用及抑制制劑。通過設計并合成靶向LINC01420的siRNA序列，轉染到鼻咽癌細胞株中，在體外培養系統和裸鼠轉移瘤體內模型中均證實靶向干擾LINC01420的表達可明顯抑制鼻咽癌細胞的侵襲與轉移能力。本專利技術為鼻咽癌的治療提供了新的途徑。附圖說明圖1為熒光定量PCR檢測發現LINC01420在鼻咽癌中表達上調情況；實時熒光定量PCR技術驗證lncRNALINC01420在鼻咽癌(26例)和慢性炎癥鼻咽上皮組織(10例)中的表達情況，LINC01420表達顯著上調(P＝0.002)。圖2為原位雜交檢測LINC01420在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表達情況；LINC01420在正常鼻咽上皮(NPE)中表達水平較低，42例正常鼻咽上皮中僅有14例(33.3％)中檢測到有LINC01420的低表達，在其余28例中檢測不到；而在110例鼻咽癌組織中有60例鼻咽癌(54.5％)中檢測到有LINC01420的高表達，其余的50例鼻咽癌組織中檢測到LINC01420的低表達；P＝0.02。LINC01420在鼻咽癌(NPC)中的表達與患者復發及遠處轉移密切相關，LINC01420表達高的患者更容易復發，LINC01420表達高的腫瘤遠處轉移的能力更強。LINC01420在鼻咽癌(NPC)中的表達與患者的性別密切相關，LINC01420表達高的患者男性偏多。圖3為鼻咽癌組織中LINC01420高表達患者預后差，更易復發和轉移；鼻咽癌中LINC01420的高表達與鼻咽癌患者的不良預后相關，即LINC01420高表達的患者總的生存時間(Over-allsurvival，OS)要明顯低于LINC01420低表達或不表達的患者。圖4為在鼻咽癌細胞中導入LINC01420的干擾siRNA序列，可顯著抑制LINC01420在鼻咽癌細胞中的表達；在鼻咽癌細胞系5-8F中導入靶向LINC01420的siRNA混合物后，實時熒光定量PCR方法檢測了鼻咽癌細胞中LINC01420的表達情況，LINC01420的表達均受到明顯的抑制。陰性對照(NC)為Scramble干擾siRNA序列。圖5為在鼻咽癌細胞中導入LINC01420的siRNA抑制LINC01420表達后，細胞侵襲能力降低；細胞穿膜(transwell)實驗證實，在鼻咽癌細胞系5-8F中轉入靶向LINC01420的siRNA，抑制LINC01420的表達后，能穿過基質膠膜的鼻咽癌細胞數目顯著減少，表明細胞侵襲能力降低。具體實施方式以下結合具體實施方式進一步說明本專利技術，而非限制本專利技術。實施例1，實時熒光定量PCR法檢測發現LINC01420在鼻咽癌中表達上調1.材料與方法：收集10例慢性鼻咽上皮組織和26例鼻咽癌組織，抽提總RNA，1μgRNA經逆轉錄成cDNA后，進行實時熒光定量PCR。LINC01420正向引物為5'-CACTCTACCCTCCGCACC-3'，如SEQNO:2所示，和反向引物'-AGGAAGTGAAATCGTGCTGA-3'。如SEQNO:3所示。用于對照的GAPDH正向引物為5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’如SEQNO:4所示，和反向引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，如SEQNO:5所示。實時熒光定量PCR反應體系實時熒光定量PCR反應步驟反應結束后確認實時熒光定量PCR的擴增曲線和熔解曲線，各基因的表達強度根據CT值(thresholdcyclevalues)、內參基因(GAPD本文檔來自技高網...

【技術保護點】
長鏈非編碼LINC01420的siRNA的應用，其特征在于，利用長鏈非編碼LINC01420的siRNA構建抑制鼻咽癌侵襲與轉移的制劑，該長鏈非編碼RNA?LINC01420的序列如SEQ?NO:1所示。

【技術特征摘要】
1.長鏈非編碼LINC01420的siRNA的應用，其特征在于，利用長鏈非編碼LINC01420的siRNA構建抑制鼻咽癌侵襲與轉移的制劑，該長鏈非編碼RNALINC01420的序列如SEQNO:1所示。2.根據權利要求1所述的長鏈非編碼LINC01420的siRNA的應用，其特征在于，長鏈非編碼LINC01420的siRNA序列為以下三條中的一條或幾條：siRNA-1：5'-CAUCUCAGGUCUCUUGGCUUUGCCA-3'，siRNA-2：5'-GCGUUGGGAUUAUCCGGAAGGAACU-3'siRNA-3：5'-CCUCUGAGAUUUAAGGCCAUGCCCU-...

【專利技術屬性】
技術研發人員：熊煒，曾朝陽，李桂源，李小玲，楊麗婷，唐艷艷，何奕，李夏雨，張文玲，周鳴，廖前進，陳攀，
申請(專利權)人：中南大學，
類型：發明
國別省市：湖南;43