丙氨酰谷氨酰胺注射液中一個(gè)四肽類雜質(zhì)的分離制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種丙氨酰谷氨酰胺注射液中一個(gè)四肽類微量雜質(zhì)的分離制備方法，包括以下步驟：1)、采用制備型高效液相色譜法對丙氨酰谷氨酰胺注射液中的四肽雜質(zhì)進(jìn)行預(yù)分離：高效液相色譜法以氨丙基鍵合硅膠為固定相，以乙腈?甲酸銨緩沖液為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫；該四肽類微量雜質(zhì)的分子式為C16H27N5O8；2)、采用制備型高效液相色譜法對步驟1)所得到的四肽雜質(zhì)粗品進(jìn)行精制純化：高效液相色譜法以氨丙基鍵合硅膠為固定相，以乙腈?甲酸緩沖液為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫；收集、合并目標(biāo)餾分并冷凍干燥，得到純化的四肽類雜質(zhì)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于藥物雜質(zhì)研究
，具體涉及丙氨酰谷氨酰胺注射液中的一個(gè)四肽類微量雜質(zhì)的分離制備方法。
技術(shù)介紹
化學(xué)藥物在臨床使用中會(huì)產(chǎn)生一些不良反應(yīng)，這個(gè)不良反應(yīng)除了與藥品本身的藥理活性有關(guān)外，與藥品中存在的雜質(zhì)也有很大關(guān)系。因此，對于化學(xué)藥品各個(gè)國家藥典均在附錄中設(shè)有專門的雜質(zhì)檢驗(yàn)通則，中國藥典二部從(2005)開始附錄中設(shè)有藥物雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則，國家食品藥品監(jiān)督管理局也發(fā)布了《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》。針對藥物中的雜質(zhì)，必須依據(jù)其生理活性制定其質(zhì)控限度，其中包括：藥品中的雜質(zhì)被有效的分離，從而保證藥品質(zhì)量，減少藥物的不良反應(yīng)。藥物雜質(zhì)的分離制備是藥物研究中最為關(guān)鍵的技術(shù)之一。中國藥典(2015年版)明確規(guī)定，丙氨酰谷氨酰胺注射液中單個(gè)未知雜質(zhì)的含量不得超過0.5％。由于丙氨酰谷氨酰胺分子結(jié)構(gòu)的特殊性，在高溫滅菌過程中易引入類似結(jié)構(gòu)副產(chǎn)物，由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的相似性，傳統(tǒng)的分離方法如萃取、重結(jié)晶、蒸餾和TLC都很難將其分離。分析型的HPLC只能獲得微克級的產(chǎn)物，為了獲得高品質(zhì)的丙氨酰谷氨酰胺注射液，需提取其主要雜質(zhì)并進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。已經(jīng)公開發(fā)表于《JournalofChromatographyA》的“Quantitativehigh-performanceliquidchromatography–tandemmassspectrometryimpurityprofilingmethodsfortheanalysisofarenteralinfusionsolutionsforaminoacidsupplementationcontainingl-alanyl-l-glutamine”(2012,1259,111-120)一文中告知了一種四肽類微量雜質(zhì)，其分子量為417.2Da，分子式為C16H27N5O8，氨基酸序列為：L-Ala-L-Glu-(L-Ala-L-Gln)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如(I)所示：
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題是提供一種丙氨酰谷氨酰胺注射液中分離制備四肽類微量雜質(zhì)的方法；以便于對丙氨酰谷氨酰胺注射液系列產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制。為了解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供一種丙氨酰谷氨酰胺注射液中一個(gè)四肽類微量雜質(zhì)的分離制備方法，包括以下步驟：1)、采用高效液相色譜法(制備型高效液相色譜法)對丙氨酰谷氨酰胺注射液中的四肽雜質(zhì)進(jìn)行預(yù)分離：所述高效液相色譜法以氨丙基鍵合硅膠為固定相，以乙腈-甲酸銨緩沖液為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫；該四肽類微量雜質(zhì)的分子式為C16H27N5O8；通過紫外檢測器的在線監(jiān)測，收集、合并目標(biāo)餾分并冷凍干燥，得四肽雜質(zhì)粗品；2)、采用高效液相色譜法(制備型高效液相色譜法)對步驟1)所得到的四肽雜質(zhì)粗品進(jìn)行精制純化：所述高效液相色譜法以氨丙基鍵合硅膠為固定相，以乙腈-甲酸緩沖液為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫；通過紫外檢測器的在線監(jiān)測，收集、合并目標(biāo)餾分并冷凍干燥，得到純化的四肽類雜質(zhì)。作為本專利技術(shù)的四肽類微量雜質(zhì)的分離制備方法的改進(jìn)：所述步驟1)中：甲酸銨緩沖液為甲酸銨水溶液，甲酸銨濃度為10mM～20mM；氨丙基鍵合硅膠的粒徑為20～30μm；流動(dòng)相中，乙腈的體積含量均為30％～60％(較佳為40％)；流動(dòng)相的pH值均為3.0～4.5(較佳為4)。所述步驟2)中：甲酸緩沖液為甲酸水溶液，甲酸體積濃度為0.1～0.2％；氨丙基鍵合硅膠的粒徑≤7μm；流動(dòng)相中，乙腈的體積含量均為30％～60％(較佳為50％)。在本專利技術(shù)中，步驟1)的洗脫流速為40～60ml/min(較佳為50ml/min)；步驟2)的洗脫流速為8～12ml/min(較佳為10ml/min)。在本專利技術(shù)中，步驟1)和步驟2)所用的氨丙基鍵合硅膠均可通過常規(guī)市購方式獲得，例如：步驟1)所用的氨丙基鍵合硅膠可購自日本YMC公司生產(chǎn)的NHG12S21的氨丙基鍵合硅膠；步驟2)所用的氨丙基鍵合硅膠可購自日本YMC公司生產(chǎn)的NH12S05-2520WT的氨丙基鍵合硅膠。本專利技術(shù)所述的丙氨酰谷氨酰胺注射液中的四肽類微量雜質(zhì)，其分子量為417.2Da，分子式為C16H27N5O8，氨基酸序列為：L-Ala-L-Glu-(L-Ala-L-Gln)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如上述(I)所示。本專利技術(shù)通過制備型高效液相色譜方法將丙氨酰谷氨酰胺注射液中的一個(gè)含量僅為0.3％的四肽類微量雜質(zhì)進(jìn)行高效分離與制備，并采用高分辨質(zhì)譜(HRMS)、一維及二維核磁共振譜(1D/2D-NMR)對該雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，最終確證其分子式及化學(xué)結(jié)構(gòu)。采用本專利技術(shù)的方法能獲得高純度的四肽類微量雜質(zhì)。本專利技術(shù)為生產(chǎn)丙氨酰谷氨酰胺注射液系列產(chǎn)品的質(zhì)量研究及雜質(zhì)定性、定量控制提供了較好的雜質(zhì)對照品，可以為申報(bào)臨床用藥制定雜質(zhì)限量提供可靠依據(jù)。附圖說明下面結(jié)合附圖對本專利技術(shù)的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽類微量雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)圖；圖2是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽類微量雜質(zhì)的色譜圖；圖3是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽類微量雜質(zhì)的高分辨質(zhì)譜圖；圖4是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽類微量雜質(zhì)的核磁共振氫譜圖；圖5是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽類微量雜質(zhì)的核磁共振碳譜圖；圖6是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽類微量雜質(zhì)的核磁共振DEPT135°譜圖；圖7是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽類微量雜質(zhì)的二維核磁共振(1H-1HCOSY)譜圖；圖8是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽類微量雜質(zhì)的二維核磁共振(HSQC)譜圖；圖9是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽類微量雜質(zhì)的核磁共振二維(HMBC)譜圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本專利技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本專利技術(shù)的保護(hù)范圍并不僅限于此。實(shí)施例1、丙氨酰谷氨酰胺注射液中一個(gè)四肽類微量雜質(zhì)的預(yù)分離：將丙氨酰谷氨酰胺注射液凍干粉400.0g用500ml蒸餾水溶解，過濾(過0.45μm孔徑的濾膜)，收集濾液備用。制備色譜分離條件為：高效液相色譜儀型號：漢邦NP7010色譜柱：50×250mm，內(nèi)裝滿氨丙基鍵合硅膠為固定相填料，該填料粒徑為20μm，孔徑為流速：50ml/min。檢測波長：215nm。流動(dòng)相：乙腈-甲酸銨緩沖液(體積比為40:60，其中甲酸銨緩沖液中的甲酸銨濃度為20mmol/l，并用甲酸調(diào)節(jié)至pH值為4.0)。洗脫方式：等度洗脫。上樣量：40.0g(50ml)。純化過程：使色譜柱平衡15分鐘后上樣并進(jìn)行等度洗脫，監(jiān)測并分段收集餾分，對所收集的餾分進(jìn)行檢測(下述藥典方法，按面積歸一化法進(jìn)行測定)，將目的峰餾分合并、除去乙腈后凍干，待后續(xù)精制分離。分十次進(jìn)樣(即，每次上樣量為4g)，重復(fù)以上操作，共獲得四肽雜質(zhì)粗品4.0g，HPLC檢測純度為60.02％(面積歸一化法，按照中國藥典2015年版通則0512進(jìn)行測定，以下同)。備注說明：洗脫時(shí)間共計(jì)50分鐘，收集第36～41分鐘的洗脫液，從而實(shí)現(xiàn)將目的峰餾分合并。實(shí)施例2、丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽類的雜質(zhì)的精制分離將實(shí)施例1中的四肽雜質(zhì)粗品4.0g用50ml蒸餾水溶解，過濾(過0.45μm孔徑的濾膜)，收集濾液備用。制備色譜精制分離條件：高效液相色譜儀型號：Waters600色譜柱：20×250mm，內(nèi)裝滿氨丙基鍵合硅膠為固定相填料，該填料粒徑為5μm，孔徑為流速：10ml/min。檢測波本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
丙氨酰谷氨酰胺注射液中一個(gè)四肽類微量雜質(zhì)的分離制備方法，其特征是包括以下步驟：1)、采用高效液相色譜法對丙氨酰谷氨酰胺注射液中的四肽雜質(zhì)進(jìn)行預(yù)分離：所述高效液相色譜法以氨丙基鍵合硅膠為固定相，以乙腈?甲酸銨緩沖液為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫；該四肽類微量雜質(zhì)的分子式為C16H27N5O8；通過紫外檢測器的在線監(jiān)測，收集、合并目標(biāo)餾分并冷凍干燥，得四肽雜質(zhì)粗品；2)、采用高效液相色譜法對步驟1)所得到的四肽雜質(zhì)粗品進(jìn)行精制純化：所述高效液相色譜法以氨丙基鍵合硅膠為固定相，以乙腈?甲酸緩沖液為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫；通過紫外檢測器的在線監(jiān)測，收集、合并目標(biāo)餾分并冷凍干燥，得到純化的四肽類雜質(zhì)。

【技術(shù)特征摘要】
1.丙氨酰谷氨酰胺注射液中一個(gè)四肽類微量雜質(zhì)的分離制備方法，其特征是包括以下步驟：1)、采用高效液相色譜法對丙氨酰谷氨酰胺注射液中的四肽雜質(zhì)進(jìn)行預(yù)分離：所述高效液相色譜法以氨丙基鍵合硅膠為固定相，以乙腈-甲酸銨緩沖液為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫；該四肽類微量雜質(zhì)的分子式為C16H27N5O8；通過紫外檢測器的在線監(jiān)測，收集、合并目標(biāo)餾分并冷凍干燥，得四肽雜質(zhì)粗品；2)、采用高效液相色譜法對步驟1)所得到的四肽雜質(zhì)粗品進(jìn)行精制純化：所述高效液相色譜法以氨丙基鍵合硅膠為固定相，以乙腈-甲酸緩沖液為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫；通過紫外檢測器的在線監(jiān)測，收集、合并目標(biāo)餾分并冷凍干燥，得到純化的四肽類雜質(zhì)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四肽類微量雜質(zhì)的分離制備方法，其特征是：所述...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：柯云翠，朱義，周娜，
申請(專利權(quán))人：杭州民生藥業(yè)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：浙江;33