一種甘蔗葉片中赤霉素含量的HPLC檢測(cè)方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種甘蔗葉片中赤霉素含量的HPLC檢測(cè)方法，包括以下步驟：S1.將待測(cè)的甘蔗葉片加入液氮磨碎，甲醇浸提，離心，取上清液，殘?jiān)眉状冀?，離心后取出上清液，合并上清液，減壓蒸發(fā)，石油醚萃取脫色，下層水相減壓蒸干，加入流動(dòng)相溶解，定容，過濾，作為樣品溶液備用；S2.采用HPLC檢測(cè)樣品溶液中赤霉素的含量。本方法能準(zhǔn)確檢測(cè)出甘蔗葉片中赤霉素含量，為研究其介導(dǎo)甘蔗梢腐病病原菌脅迫應(yīng)答的生化機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及甘蔗梢腐病檢測(cè)
，特別是一種甘蔗葉片中赤霉素含量的HPLC檢測(cè)方法。
技術(shù)介紹
甘蔗（Saccharumofficinarum)是我國(guó)最重要糖料作物，蔗糖占我國(guó)食糖總產(chǎn)92%。由于梢腐病逐漸表現(xiàn)出無區(qū)域性和無規(guī)律性等特點(diǎn)，導(dǎo)致該病對(duì)甘蔗產(chǎn)業(yè)的危害日趨嚴(yán)重。在巴西、印度、伊朗、馬來西亞以及我國(guó)等蔗區(qū)各類梢腐病癥狀層出不窮，尤其在高溫高濕季節(jié)容易暴發(fā)此病。據(jù)2012-2014年廣西甘蔗品種區(qū)域試驗(yàn)以及2013-2014年國(guó)家甘蔗品種區(qū)域試驗(yàn)調(diào)查，參試品種發(fā)病率達(dá)到100%。此病害可導(dǎo)致甘蔗株高顯著降低，產(chǎn)量減少5%～20%，糖分降低達(dá)3%。甘蔗在受到梢腐病病原侵染時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一系列的防御反應(yīng)來保護(hù)自己，與此同時(shí)，病原真菌也會(huì)通過改變自身毒性或產(chǎn)生變異，由此影響甘蔗正常生理生化進(jìn)程，從而感染甘蔗并導(dǎo)致發(fā)病。赤霉素作為一種重要的植物內(nèi)源激素，其參與甘蔗生理代謝過程一個(gè)突出特點(diǎn)是促使蔗莖的伸長(zhǎng)和蔗株增高。而甘蔗是以蔗莖作為收獲產(chǎn)品的作物，因此在生產(chǎn)中增加蔗株高度對(duì)于提高甘蔗產(chǎn)量是相當(dāng)重要的。但至今尚無建立高效、精確的甘蔗梢腐病葉片赤霉素含量檢測(cè)方法，鑒于我國(guó)甘蔗梢腐病發(fā)生逐漸加重的趨勢(shì)，因此建立一套快速有效的甘蔗梢腐病葉片赤霉素含量檢測(cè)方法對(duì)研究其介導(dǎo)甘蔗梢腐病病原菌脅迫應(yīng)答的生化機(jī)制具有非常重要的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
針對(duì)我國(guó)甘蔗梢腐病葉片赤霉素含量檢測(cè)方法的空白，本專利技術(shù)的目的在于提供一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的甘蔗葉片中赤霉素含量的HPLC檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用的技術(shù)方法如下：一種甘蔗葉片中赤霉素含量的HPLC檢測(cè)方法，包括以下步驟：S1.待測(cè)的甘蔗葉片加入液氮磨碎，加入預(yù)冷至2~5℃的體積分?jǐn)?shù)為70~90%甲醇水溶液，2~5℃浸提10~20h，離心，取上清液，殘?jiān)偌尤腩A(yù)冷至2~5℃的體積分?jǐn)?shù)為70~90%甲醇水溶液浸提1~3h，離心后取出上清液，重復(fù)殘?jiān)岷碗x心操作0~3次，合并上清液，30~40℃下減壓蒸發(fā)至不含甲醇，加入石油醚萃取脫色2~5次，棄去上層有機(jī)相，下層水相在30~40℃下減壓蒸干，加入HPLC檢測(cè)所用流動(dòng)相溶解，定容，過濾，作為樣品溶液備用；S2.采用HPLC檢測(cè)樣品溶液中赤霉素的含量。進(jìn)一步的，所述步驟S2中，HPLC色譜條件為：流動(dòng)相由甲醇、超純水和乙酸按體積比200:300:3混合制成，柱溫為32~38℃，流速0.8~1.2ml/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)306nm。更進(jìn)一步的，HPLC色譜條件為：柱溫為35℃，流速1ml/min，進(jìn)樣量10μL。進(jìn)一步的，所述步驟S1中，所述待測(cè)的甘蔗葉片在冰盒下剪下。進(jìn)一步的，所述步驟S1中，待測(cè)的甘蔗葉片和殘?jiān)岵捎玫氖求w積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇水溶液。進(jìn)一步的，所述步驟S1中，待測(cè)的甘蔗葉片和殘?jiān)岬臏囟葹?℃。進(jìn)一步的，所述步驟S1中，待測(cè)甘蔗葉片采用甲醇水溶液進(jìn)行浸提，液固比為0.2~0.5g/mL。進(jìn)一步的，所述步驟S5中，加入流動(dòng)相溶解后，采用0.45μm微孔濾膜進(jìn)行過濾。進(jìn)一步的，所述步驟S1中，待測(cè)的甘蔗葉片和殘?jiān)岵捎玫募状妓芤簽榧状?超純水溶液。本專利技術(shù)還進(jìn)一步提供了以上所述的檢測(cè)方法在判斷甘蔗品種對(duì)梢腐病感性和抗性差異方面的應(yīng)用。本專利技術(shù)的有益效果是：1）樣品前處理方法采用甲醇-超純水提取劑結(jié)合超聲波萃取法提取赤霉素；并通過石油醚脫色對(duì)樣品進(jìn)行提純；與其他方法相比，除雜效果好，提取時(shí)間短，待測(cè)樣品純凈度高。2）通過本專利技術(shù)HPLC色譜條件測(cè)量樣品溶液中赤霉素的含量，赤霉素能與其他有效成分較好地進(jìn)行分離，且樣品保留時(shí)間穩(wěn)定，具有更好的峰形，在具備高效液相色譜儀的實(shí)驗(yàn)室均能通過此法開展赤霉素含量檢測(cè)工作。3）本專利技術(shù)能檢測(cè)甘蔗處理前后葉片赤霉素含量變化，檢測(cè)結(jié)果表明：接種處理與正常生長(zhǎng)的甘蔗葉片赤霉素含量存在顯著差異，且差異性趨勢(shì)增大；正常生長(zhǎng)的甘蔗葉片中赤霉素含量會(huì)逐漸上升，接種處理的甘蔗葉片中赤霉素含量逐漸下降；該檢測(cè)結(jié)果為研究其介導(dǎo)甘蔗梢腐病病原菌脅迫應(yīng)答的生化機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。同時(shí)，該方法的推廣使用，對(duì)于篩選抗病品種和指導(dǎo)甘蔗抗病育種具有重要意義和現(xiàn)實(shí)作用。附圖說明圖1為赤霉素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。圖2a為標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)得到的色譜圖。圖2b為樣品溶液檢測(cè)得到的色譜圖。圖3為不同生長(zhǎng)階段甘蔗接種樣品和甘蔗對(duì)照樣品中赤霉素含量的趨勢(shì)分析圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本專利技術(shù)作進(jìn)一步詳細(xì)的闡述，但本專利技術(shù)的實(shí)施方式并不局限于實(shí)施例表示的范圍。這些實(shí)施例僅用于說明本專利技術(shù)，而非用于限制本專利技術(shù)的范圍。此外，在閱讀本專利技術(shù)的內(nèi)容后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本專利技術(shù)作各種修改，這些等價(jià)變化同樣落于本專利技術(shù)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例1甘蔗葉片中赤霉素含量的HPLC檢測(cè)方法。S1.選取感染甘蔗梢腐病病原的甘蔗葉片作為待測(cè)樣品，取待測(cè)樣品2g加入液氮磨碎，加入10mL預(yù)冷至4℃的體積分?jǐn)?shù)80%甲醇水溶液，保鮮膜密封后于4℃浸提16h；然后于4℃條件下以8000r/min離心10min得上清液，殘?jiān)?mL預(yù)冷至4℃的體積分?jǐn)?shù)其80%甲醇水溶液浸提2h，離心10min后取出上清液，合并兩次上清液于40℃減壓蒸發(fā)至不含甲醇（約剩0.3mL水溶液），加入15mL石油醚萃取脫色3次，棄去上層有機(jī)相，下層水相40℃下減壓蒸干，加入0.5mLHPLC檢測(cè)所用流動(dòng)相溶解，定容至2mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾于帶有內(nèi)襯管的樣品瓶?jī)?nèi)，作為樣品溶液。S2.采用HPLC檢測(cè)樣品溶液中水楊酸的含量。S2-1.色譜條件：ARigolL3000高效液相色譜儀；色譜柱：KromasilC18反相色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：200mL甲醇和300mL超純水混合，加入3mL乙酸；柱溫：35℃；走樣時(shí)間為20min；流速：0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：306nm；進(jìn)樣體積：10μL。S2-2.稱取赤霉素標(biāo)準(zhǔn)品1.25mg，加入10mL水溶解，配置成125μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液母液；然后用標(biāo)準(zhǔn)溶液母液再一次稀釋成濃度分別為25μg/mL、12.5μg/mL、1.25μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用S2-1的色譜條件檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液母液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，其對(duì)應(yīng)峰面積分別為51.256、7.311、4.571、0.272；然后以峰面積為縱坐標(biāo)、以赤霉素濃度為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所述，由圖1可見，在所檢測(cè)范圍內(nèi)(1.25μg/mL～125μg/mL)，回歸方程式為y=0.4175x-1.2383，液相色譜峰面積與赤霉素濃度具有良好的線性關(guān)系(R2=0.9971)。S2-3.專屬性考察：分別取125μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液母液和樣品溶液注入液相色譜儀中，按照S2-1的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，赤霉素的保留時(shí)間為7.77min，標(biāo)準(zhǔn)溶液母液檢測(cè)結(jié)果見圖2a，樣品溶液檢測(cè)結(jié)果見圖2b。S2-4.加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)：分別向同一樣品溶液中添加1mL的濃度為10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、50μg/mL的赤霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照5.1的液相色譜條件檢測(cè)，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。表1赤霉素回收率測(cè)定結(jié)果S2-5.方法精密度試驗(yàn)：取濃度為1.25μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照S2-1的色譜條件檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣5針觀察保留時(shí)間與峰面積，結(jié)本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種甘蔗葉片中赤霉素含量的HPLC?檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟：S1.?待測(cè)的甘蔗葉片加入液氮磨碎，加入預(yù)冷至2~5℃的體積分?jǐn)?shù)為70~90%甲醇水溶液，2~5℃浸提10~20h，離心，取上清液，殘?jiān)偌尤腩A(yù)冷至2~5℃的體積分?jǐn)?shù)為70~90%甲醇水溶液浸提1~3h，離心后取出上清液，重復(fù)殘?jiān)岷碗x心操作0~3次，合并上清液，30~40℃下減壓蒸發(fā)至不含甲醇，加入石油醚萃取脫色2~5次，棄去上層有機(jī)相，下層水相在30~40℃下減壓蒸干，加入HPLC檢測(cè)所用流動(dòng)相溶解，定容，過濾，作為樣品溶液備用；S2.采用HPLC檢測(cè)樣品溶液中赤霉素的含量。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種甘蔗葉片中赤霉素含量的HPLC檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟：S1.待測(cè)的甘蔗葉片加入液氮磨碎，加入預(yù)冷至2~5℃的體積分?jǐn)?shù)為70~90%甲醇水溶液，2~5℃浸提10~20h，離心，取上清液，殘?jiān)偌尤腩A(yù)冷至2~5℃的體積分?jǐn)?shù)為70~90%甲醇水溶液浸提1~3h，離心后取出上清液，重復(fù)殘?jiān)岷碗x心操作0~3次，合并上清液，30~40℃下減壓蒸發(fā)至不含甲醇，加入石油醚萃取脫色2~5次，棄去上層有機(jī)相，下層水相在30~40℃下減壓蒸干，加入HPLC檢測(cè)所用流動(dòng)相溶解，定容，過濾，作為樣品溶液備用；S2.采用HPLC檢測(cè)樣品溶液中赤霉素的含量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗葉片中赤霉素含量的HPLC檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟S2中，HPLC色譜條件為：流動(dòng)相由甲醇、超純水和乙酸按體積比200:300:3混合制成，柱溫為32~38℃，流速0.8~1.2ml/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)306nm。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的甘蔗葉片中赤霉素含量的HPLC檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟S2中，HPLC色譜條件為：柱溫為35℃，流速1ml/min，進(jìn)樣量1...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王澤平，劉璐，李毅杰，段維興，梁強(qiáng)，張革民，羅霆，韋金菊，高軼靜，林波，周珊，楊翠芳，林善海，張保青，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：廣西;45