一種利用生物柴油副產物甘油合成D?乳酸的重組菌及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種利用生物柴油副產物甘油合成D?乳酸的重組菌及其應用，屬于基因工程領域。本發明專利技術提供的重組菌，是將D?乳酸脫氫酶基因ldhA導入敲除了1,3?丙二醇氧化還原酶基因dhaT和醛還原酶/醇脫氫酶基因yqhD的宿主重組肺炎克雷伯氏菌中得到的工程菌株。本發明專利技術實現了以生物柴油副產物甘油為底物合成D?乳酸，在搖瓶水平，產量和轉化率分別達到12.7g/L和50.4％，光學純度為100％，具有光學純度和轉化率高、生產成本低的特點。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種利用生物柴油副產物甘油合成D-乳酸的重組菌及其應用，屬于基因工程

技術介紹
隨著社會的發展，化石能源日益匱乏，由可再生原料合成生物燃料成為世界性研究熱點。生物柴油是一種重要生物燃料，生產呈逐年增加趨勢。生物柴油的生產，會產生大量的副產物甘油。據估算，每生產10噸生物柴油大約生成1噸粗甘油。甘油的大規模剩余，致使其價格處于持續偏低水平，已經成為一種資源豐富、價格低廉、亟待開發的碳源物質。D-乳酸是一種重要的平臺化合物，被廣泛應用于醫藥、農藥和化妝品等行業。高光學純度D-乳酸可以作為聚乳酸的優良單體。將D-乳酸聚合單體以一定比例加入聚L-乳酸后，聚乳酸的機械性能、熱力學性能等都會得到改善，熔點能夠提高50℃左右。全球D-乳酸的需求量約2.6萬噸，每年都以6％～8％的速度增長。全球聚乳酸市場每年約以20％～30％的速率增長；隨著聚乳酸市場的逐漸推廣，D-乳酸的需求量將進一步增加。D-乳酸的合成方法主要有化學合成法、微生物酶法和微生物發酵法，綜合考慮光學純度、生產成本、產物濃度以及環境污染等因素，微生物發酵法存在一定優勢。D-乳酸的發酵菌株以乳酸菌為主。乳酸菌是傳統的乳酸發酵菌種，對乳酸的耐受性高、生產強度大、自身能夠合成高濃度的乳酸。但是，大多數乳酸菌同時合成L-乳酸和D-乳酸，光學純度比較差；想要得到高光學純度的D-乳酸，需要將生產L-乳酸的關鍵酶L-乳酸脫氫酶敲除。還有一些乳酸菌，如Lactobacillussakei、Lactobacilluscurvatus和Lactobacillusplantarum等乳桿菌還存在乳酸消旋酶，該酶的存在使得菌株即使只有單一的乳酸脫氫酶，最終發酵產物只能是D,L-乳酸。另一方面，現有技術主要是以玉米等淀粉質原料發酵合成D-乳酸，受國家政策的影響，原材料價格較高。
技術實現思路
本專利技術首先提供了一種利用生物柴油副產物甘油合成D-乳酸的重組菌。所述重組菌是以肺炎克雷伯氏菌為出發菌株，將編碼D-乳酸脫氫酶的基因ldhA導入肺炎克雷伯氏菌，或者導入敲除了編碼1,3-丙二醇氧化還原酶的基因dhaT和/或編碼醛還原酶/醇脫氫酶的基因yqhD的肺炎克雷伯氏菌，得到重組菌。在本專利技術的一種實施方式中，所述D-乳酸脫氫酶基因ldhA，來源于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)基因登錄號為GI：6938538。本專利技術還提供一種構建所述重組菌的方法，包括以下步驟：1)PCR擴增肺炎克雷伯氏菌的1,3-丙二醇脫氫酶基因dhaT的上下游同源臂片段，拼接后得到基因敲除片段ΔdhaT。所獲得的基因敲除片段ΔdhaT和自殺質粒pRE112進行酶切、連接；2)將步驟1)所得的重組載體轉化到E.colix7213；3)將步驟2)所獲得的重組菌與肺炎克雷伯氏菌共同培養，通過重組載體與肺炎克雷伯氏菌進行同源重組，獲得敲除dhaT基因的基因缺失型菌株K.penumoniaeΔdhaT；4)在K.penumoniaeΔdhaT基礎上，參照步驟1)～3)所述步驟繼續敲除醛還原酶/醇脫氫酶基因yqhD得到K.peneumoniaeΔdhaTΔyqhD；5)克隆D-乳酸脫氫酶基因ldhA，將所得基因與質粒pBAD18進行酶切、連接，并轉入E.coliDH5α感受態細胞中，篩選陽性克隆；6)培養步驟5)所得的陽性克隆，并提取質粒，將所得的重組質粒pBAD18-LdhA，轉化到宿主K.penumoniaeΔdhaT或者K.peneumoniaeΔyqhD或者K.peneumoniaeΔdhaTΔyqhD中，獲得肺炎克雷伯氏菌重組菌。本專利技術還提供一種應用所述重組菌發酵生產D-乳酸的方法，步驟如下：1)活化重組菌，獲得種子液；2)將步驟1)所得的種子液，與含有卡那霉素的培養基，按照體積比種子液：發酵培養基＝1～2:100～130的比例接種后，35℃～37℃，180～220rpm條件下培養至OD600在0.6～0.8，獲得培養液；3)所得的培養液加入誘導劑阿拉伯糖至終濃度為0.01％～0.1％，然后轉入30～33℃，180～220rpm條件下繼續培養24～48小時。在本專利技術的一種實施方式中，步驟2)所述培養條件為：37℃、180rpm。在本專利技術的一種實施方式中，發酵培養基的碳源為低成本的生物柴油副產物甘油，氮源為無機氮源，例如氯化銨、硫酸銨等，其他成分為簡單的無機鹽成分。在本專利技術的一種實施方式中，發酵培養基的配方為：0.42g/L一水合檸檬酸，1.6g/LNH4Cl，1g/L酵母粉，0.2g/LMgSO4·7H2O，100mmol/LpH＝7.0磷酸鉀緩沖液，40g/L生物柴油副產物甘油。在本專利技術的一種實施方式中，所述生物柴油副產物甘油的組成是：75.1％甘油，22.8％水，1.7％脂肪酸，0.12％甲醇，0.28％脂肪酸甲酯。在本專利技術的一種實施方式中，將重組菌活化后，按1％的接種量接種到含100μg·mL-1的卡那霉素的發酵培養基中，37℃、180rpm條件下振蕩培養，待OD600達到0.6時，溫度調節至33℃，并加入0.01％阿拉伯糖進行誘導；此后，每隔12h添加一次0.01％～0.1％的阿拉伯糖和50mg/mL的卡那霉素，阿拉伯糖誘導后48h終止發酵。本專利技術所獲得的的有益效果如下：針對以上問題，本專利技術以Klebsiellapneumoniae為宿主菌株，通過構建工程菌，以廉價的生物柴油副產物甘油為碳源，實現了100％光學純度D-乳酸的合成，在產量和成本上具有一定優勢。本專利技術所構建的重組菌具有利用生物柴油副產物甘油為唯一碳源合成D-乳酸的特點，發酵48h，可以得到12.7g/L的D-乳酸，轉化率為50.4％，光學純度為100％。以生物柴油煉制的副產物甘油為碳底物，降低了生產成本；通過進一步改良培養基和發酵條件，使產物轉化率得到了提高。定義和縮寫在本文中使用下列的縮寫或簡稱：D-乳酸脫氫酶基因：ldhA1,3-丙二醇脫氫酶基因：dhaT醛還原酶/醇脫氫酶基因：yqhD肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)：K.penumoniae“基因缺失”或“基因敲除”指將目標基因從基因組中刪除或使目標基因中的一部分刪除，從而使目標基因失去表達其對應功能的蛋白質，導致功能缺失?！半姄艮D化”或“電轉化”指分子生物學中轉染技術的一種，用來將外來基因整合到宿主基因中并穩定表達，其利用高壓電脈沖的電擊穿孔作用將外來基因導入宿主基因或將外來質粒導入宿主原生質體，又稱電擊法或電融合法等?！斑^量表達”或“過表達”指特定的基因在生物體中大量表達，表達量超過正常水平(即，野生型表達水平)，可以通過增強內源表達或引入外源基因來實現。具體實施方式下面通過實例來進一步闡明本專利技術。但本專利技術并不限于以下實施例。下述實施例中所使用的實驗方法若無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所使用的材料、試劑等若無特殊說明，均可從商業途徑獲得。所用酶試劑購自MBIFermentas公司，提取質粒所用的試劑盒和回收DNA片段所用的試劑盒購自美國OMEGA公司，相應的操作步驟按照產品說明書進行；所有培養基如無特別說明均用去離子水配制。培養基配方：1)種子液搖瓶培養基LB培養基：5g\本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種利用生物柴油副產物甘油合成D?乳酸的重組菌，其特征在于，所述重組菌是以肺炎克雷伯氏菌為出發菌株，將編碼D?乳酸脫氫酶的基因ldhA導入肺炎克雷伯氏菌，或者導入敲除了編碼1,3?丙二醇氧化還原酶的基因dhaT和/或編碼醛還原酶/醇脫氫酶的基因yqhD的肺炎克雷伯氏菌，得到重組菌。

【技術特征摘要】
1.一種利用生物柴油副產物甘油合成D-乳酸的重組菌，其特征在于，所述重組菌是以肺炎克雷伯氏菌為出發菌株，將編碼D-乳酸脫氫酶的基因ldhA導入肺炎克雷伯氏菌，或者導入敲除了編碼1,3-丙二醇氧化還原酶的基因dhaT和/或編碼醛還原酶/醇脫氫酶的基因yqhD的肺炎克雷伯氏菌，得到重組菌。2.根據權利要求1所述的重組菌，其特征在于，所述D-乳酸脫氫酶基因ldhA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.一種構建權利要求1或2所述重組菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：1)PCR擴增肺炎克雷伯氏菌的1,3-丙二醇脫氫酶基因dhaT的上下游同源臂片段，拼接后獲得基因敲除片段ΔdhaT，所獲得的基因敲除片段ΔdhaT和自殺質粒pRE112進行酶切、連接；2)將步驟1)所得的重組載體轉化到E.colix7213；3)將步驟2)所獲得的重組菌與肺炎克雷伯氏菌共同培養，通過重組載體與肺炎克雷伯氏菌同源重組，獲得敲除dhaT基因的基因缺失型菌株K.penumoniaeΔdhaT；4)在K.penumoniaeΔdhaT基礎上，參照步驟1)～3)所述步驟繼續敲除醛還原酶/醇脫氫酶基因yqhD得到K.peneumoniaeΔdhaTΔyqhD；5)克隆D-乳酸脫氫酶基因ldhA，將所得基因與質粒pBAD18進行酶切、連接，并轉入E.coliDH5α感受態細胞中，篩選陽性克??；6)培養步驟5)所得的陽性克隆，并提取質粒，將所得的重組質粒pBAD18-LdhA，轉化到宿主K.penumoniaeΔdhaT或者K.peneumoniaeΔyqhD或者K.peneumoniaeΔdhaTΔyqhD中，獲得肺炎克雷伯氏菌重組菌。4.一種應用權利要求1或2所述的重組菌發酵生產D-乳酸...

【專利技術屬性】
技術研發人員：趙廣，馮新軍，咸漠，
申請(專利權)人：中國科學院青島生物能源與過程研究所，
類型：發明
國別省市：山東;37