一種耐高濃度葡萄糖的β-葡萄糖苷酶高通量篩選方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種耐高濃度葡萄糖的β-葡萄糖苷酶高通量篩選方法，主要步驟：將β-葡萄糖苷酶于含有七葉苷和枸櫞酸鐵銨的平板培養(yǎng)基上進(jìn)行分泌表達(dá)，挑取陽性克隆子于普通平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，再將一定體積的七葉苷、枸櫞酸鐵銨和一定濃度葡萄糖的溶液加入到普通平板培養(yǎng)基上，于一定溫度下反應(yīng)1-2h，獲得能產(chǎn)生黑色光圈的突變酶。本發(fā)明專利技術(shù)所述的耐高濃度葡萄糖抑制的β-葡萄糖苷酶高通量篩選方法，可應(yīng)用于基于定向進(jìn)化的耐高濃度葡萄糖抑制β-葡萄糖苷酶的高通量篩選，使耐高濃度葡萄糖的β-葡萄糖苷酶更適合于再生生物質(zhì)纖維素糖化的能源和食品工業(yè)的風(fēng)味增加等領(lǐng)域。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于β-葡萄糖苷酶耐葡萄糖抑制篩選領(lǐng)域，涉及基于顯色化合物平板培養(yǎng)基篩選的耐葡萄糖抑制的高通量篩選方法。
技術(shù)介紹
β-葡萄糖苷酶是纖維素糖化最關(guān)鍵的限速酶，廣泛用于可再生生物質(zhì)資源的能源應(yīng)用領(lǐng)域以及食品工業(yè)領(lǐng)域。纖維素的降解主要涉及到三種纖維素酶，分別是纖維素外切酶、纖維素內(nèi)切酶和β-葡萄糖苷酶，纖維素外切酶主要作用于微晶纖維素的還原端或非原端生成纖維二糖，而纖維素內(nèi)切酶主要作用于不定形纖維素的內(nèi)部產(chǎn)生纖維二糖和纖維寡糖，β-葡萄糖苷酶主要作用于纖維二糖和纖維寡糖生成葡萄糖。為了實(shí)現(xiàn)二代生物燃料的工業(yè)化生產(chǎn)，節(jié)約生產(chǎn)成本以及提高反應(yīng)器容積效率是首要任務(wù)，因此，增加預(yù)處理纖維素濃度是一種很好的解決方案，在高濃度生物質(zhì)降解過程中，β-葡萄糖苷酶會(huì)受到高濃度葡萄糖抑制而失去活性，造成大量纖維二糖積累，因?yàn)楦?jìng)爭(zhēng)性抑制和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的影響，同時(shí)導(dǎo)致纖維素外切酶和纖維素內(nèi)切酶活性的完全喪失，纖維素停止了酶解反應(yīng)。很多研究團(tuán)隊(duì)已采用定向進(jìn)化技術(shù)改造β-葡萄糖苷酶，但是主要用于獲得高活性、高穩(wěn)定性的β-葡萄糖苷酶的篩選，因此，為了解決β-葡萄糖苷酶受高濃度抑制的問題，采用定向進(jìn)化技術(shù)是一種不錯(cuò)的選擇，然而目前尚未發(fā)現(xiàn)類似報(bào)道，其中很可能最主要原因是沒有找到一個(gè)合適的高通量篩選方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
基于以上所存在的問題，本專利技術(shù)提供了一種基于平板篩選技術(shù)用于獲得耐高濃度葡萄糖的β-葡萄糖苷酶高通量篩選方法，對(duì)比其它篩選方法，本專利技術(shù)方法簡(jiǎn)便實(shí)用，特別適用于真菌和細(xì)菌β-葡萄糖苷酶的高通量篩選領(lǐng)域。本專利技術(shù)是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種耐高濃度葡萄糖抑制的β-葡萄糖苷酶高通量篩選方法，其特征在于采用顯色化合物平板培養(yǎng)基進(jìn)行高通量篩選，其主要步驟：1)將β-葡萄糖苷酶于含有七葉苷和枸櫞酸鐵銨的平板培養(yǎng)基上進(jìn)行分泌表達(dá)；2)挑取陽性克隆子于普通平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；3)再將3-10mL的七葉苷、枸櫞酸鐵銨和一定濃度葡萄糖的溶液加入到長(zhǎng)有陽性克隆子的普通平板培養(yǎng)基上，于25-70℃下反應(yīng)1-2h，獲得能產(chǎn)生黑色光圈的突變酶。所述的“含有七葉苷和枸櫞酸鐵銨的平板培養(yǎng)基”，其特征在于七葉苷濃度為0.1-0.2％、枸櫞酸鐵銨濃度為0.25-2％。所述的“七葉苷、枸櫞酸鐵銨和一定濃度葡萄糖的溶液”，其特征在于七葉苷濃度為0.1-0.2％、枸櫞酸鐵銨濃度為1-2％和葡萄糖濃度為0-50％。本專利技術(shù)的技術(shù)效果是：本專利技術(shù)所述的耐高濃度葡萄糖抑制的β-葡萄糖苷酶高通量篩選方法，可應(yīng)用于基于定向進(jìn)化的耐高濃度葡萄糖抑制β-葡萄糖苷酶的高通量篩選，使耐高濃度葡萄糖的β-葡萄糖苷酶更適合于再生生物質(zhì)纖維素糖化的能源和食品工業(yè)的風(fēng)味增加等領(lǐng)域。具體實(shí)施方式通過以下具體實(shí)施例，對(duì)本專利技術(shù)作詳細(xì)說明，本專利技術(shù)的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本專利技術(shù)中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護(hù)范圍。實(shí)施本專利技術(shù)的過程、條件、試劑、實(shí)驗(yàn)方法等，除本領(lǐng)域的普遍知識(shí)和公知常識(shí)外，本專利技術(shù)沒有特別限制內(nèi)容。1、將本實(shí)驗(yàn)室所保存的草酸青霉16β-葡萄糖苷酶基因與pGAPZαA載體連接，以2000伏電壓電轉(zhuǎn)到畢赤酵母GS115中；2、將上述重組菌畢赤酵母GS115涂布于含有0.1％七葉苷和0.25％枸櫞酸鐵銨的YPG(碳源僅有2％甘油)平板培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)3-7天，挑取菌落周圍有黑色光圈的陽性克隆子；3、將陽性克隆子分別接種到4塊相同的YPG(碳源僅有2％甘油)平板培養(yǎng)基中，于30℃分別培養(yǎng)2-5天；4、將4mL的0.16％七葉苷、1.2％枸櫞酸鐵銨和0％葡萄糖加入到1塊陽性克隆子平板上，將4mL的0.16％七葉苷、1.2％枸櫞酸鐵銨和0.5％葡萄糖加入到第2塊陽性克隆子平板上，將4mL的0.16％七葉苷、1.2％枸櫞酸鐵銨和20％葡萄糖加入到第3塊陽性克隆子平板上，于40℃分別培養(yǎng)2-3h，第4塊陽性克隆子平板保存。5、加了20％葡萄糖的第3塊平板完全受到抑制，陽性克隆子周圍沒有形成黑色光圈，而其它兩塊平板都有黑色光圈形成。6、前期研究表明(論文已發(fā)表)，草酸青霉16β-葡萄糖苷酶在0-1％葡萄糖濃度下不會(huì)受到抑制，當(dāng)在>5％葡萄糖時(shí)會(huì)受到抑制，我們實(shí)驗(yàn)完全證實(shí)平板高通量篩選耐高濃度葡萄糖的可靠性和方便性。本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種耐高濃度葡萄糖的β?葡萄糖苷酶高通量篩選方法，其特征在于采用顯色化合物平板培養(yǎng)基進(jìn)行高通量篩選耐糖β?葡萄糖苷酶，其特征是主要步驟：1)將β?葡萄糖苷酶于含有七葉苷和枸櫞酸鐵銨的平板培養(yǎng)基上進(jìn)行分泌表達(dá)；2)挑取陽性克隆子于普通平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；3)再將3?10mL的七葉苷、枸櫞酸鐵銨和一定濃度葡萄糖的溶液加入到長(zhǎng)有陽性克隆子的普通平板培養(yǎng)基上，于25?70℃下反應(yīng)1?2h，獲得能產(chǎn)生黑色光圈的突變酶。

【技術(shù)特征摘要】
2016.02.02 CN 20161007052511.一種耐高濃度葡萄糖的β-葡萄糖苷酶高通量篩選方法，其特征在于采用顯色化合物
平板培養(yǎng)基進(jìn)行高通量篩選耐糖β-葡萄糖苷酶，其特征是主要步驟：
1)將β-葡萄糖苷酶于含有七葉苷和枸櫞酸鐵銨的平板培養(yǎng)基上進(jìn)行分泌表達(dá)；
2)挑取陽性克隆子于普通平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；
3)再將3-10mL的七葉苷、枸櫞酸鐵銨和一定濃度葡萄糖的溶液加入到長(zhǎng)有陽性克隆...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：趙喜華，易拾，涂宗財(cái)，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：江西師范大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：江西;36