一種嬰幼兒配方乳粉中細菌的溯源方法組成比例

本發明專利技術提供一種嬰幼兒配方乳粉中細菌的溯源方法，其步驟為：對嬰幼兒配方乳粉原輔料、生產環境中的細菌進行分離；對分離菌株進行DNA的提取；利用通用引物FA?27F：5'?AGTCTCTGATCATGCCTCAG?3'和RA?1492R：5'?AAGGAGGTGCTCCAGCC?3'，進行16S?rDNA序列的PCR擴增，擴增產物在1％的瓊脂糖凝膠電泳上進行檢測；對步驟(3)16S?rDNA序列PCR擴增產物進行測序；將獲得菌株的16S?rRNA基因序列利用DNAStar中的MEGA軟件構建系統發育樹，通過發育樹分析達到對嬰幼兒配方乳粉中的細菌進行溯源的目的。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于食品安全領域，具體涉及一種嬰幼兒配方乳粉中細菌的溯源方法。
技術介紹
嬰幼兒配方乳粉作為母乳的首要替代物，是嬰幼兒重要的攝食來源，為嬰幼兒健康成長和發展提供幾乎全部的蛋白質、脂質、維生素、礦物質等營養物質。嬰幼兒配方乳粉要求是一個無有害菌的產品，而其生產所用的原輔料容易污染細菌，其生產過程也并不是一個絕對無菌的環境。正是由于加工過程中這種非絕對無菌特點，導致嬰幼兒配方乳粉可能被來源于原輔料以及生產過程中的病原菌污染，進而對嬰幼兒健康產生不良影響。目前對嬰幼兒配方乳粉中細菌的防控局限于對成品或原輔料、生產環境的單一檢測單一防控，不能達到從根源上追溯成品中細菌來源，針對性防控的目的。
技術實現思路
針對上述問題，本專利技術提供一種嬰幼兒配方乳粉中細菌的溯源方法，達到從根本上針對性防控細菌的方法。包括以下步驟：1)對嬰幼兒配方乳粉原輔料、生產環境中的細菌進行分離；2)對分離菌株進行DNA的提取；3)利用通用引物FA-27F：5'-AGTCTCTGATCATGCCTCAG-3'和RA-1492R：5'-AAGGAGGTGCTCCAGCC-3'，進行16SrDNA序列的PCR擴增，擴增產物在1％的瓊脂糖凝膠電泳上進行檢測；4)對步驟(3)16SrDNA序列PCR擴增產物進行測序；5)將獲得菌株的16SrRNA基因序列利用DNAStar中的MEGA軟件構建系統發育樹，通過發育樹分析達到對嬰幼兒配方乳粉中的細菌進行溯源的目的。具體步驟為：(1)對嬰幼兒配方乳粉的原輔料、生產環境空氣、生產環境表面進行取樣；富集培養分離細菌；(2)按照TIANamp細菌基因組DNA提取試劑盒要求的具體方法對分離菌株進行DNA的提取；(3)16SrDNA序列的PCR擴增：利用通用引物FA-27F：5'-AGTCTCTGATCATGCCTCAG-3'和RA-1492R：5'-AAGGAGGTGCTCCAGCC-3'，進行序列的擴增。PCR擴增體系為：16μL2×TaqPCRMasterMix，上下游引物各1μL，DNA模板2μL，30μLddH2O。擴增條件：94℃預變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1.5min，30個循環；72℃末端延伸7min；取5μLPCR擴增產物在1％的瓊脂糖凝膠電泳上進行檢測，電壓為5V/cm，電泳液為1×TAE，添加溴化乙錠(EB)染色后電泳30min，在凝膠成像系統下觀察電泳條帶情況；(4)將步驟(3)得到的16SrDNA序列的PCR擴增產物進行測序；(5)將獲得的16SrRNA基因序列利用DNAStar中的MEGA軟件構建系統發育樹，通過發育樹分析達到對嬰幼兒配方乳粉中的細菌進行溯源的目的。附圖說明圖1嬰幼兒配方乳粉加工流程圖；圖2部分分離菌株的DNA提取電泳鑒定；圖3部分分離菌株的PCR擴增產物電泳圖:M：markerDL2000；1～10：分離菌株PCR產物；圖4肺炎克雷伯菌的16SrRNA基因序列的系統發育樹:(菌株的分離來源：A26-原料乳，A25-原料乳乳，A22-原料乳，A5-乳清粉，A1-乳清粉，A4-乳清粉，A6-礦物質，A16-營養素，A17-營養素，A28-酪蛋白磷酸肽，A18-碳酸鈣)；圖5基于操作分類單元(97％相似水平)相對含量的12樣品中細菌群落結構分布圖；圖6冬季各樣品中細菌在屬水平上的分布；圖7夏季各樣品中細菌在屬水平上的分布.具體實施方式以下實施例使用主要生化試劑如表1所示。表1本實驗主要生化試劑所用的主要儀器設備及軟件如表2所示。表2儀器設備和軟件實施例1樣品采集研究中所用的所有樣品(原輔料樣品、空氣樣品、表面涂抹樣品)，均由本實驗室人員分別于冬季(2014年11月)和夏季(2015年6月)采集自某嬰幼兒配方乳粉加工廠。原輔料樣品信息見表3，每類樣品每次采集三份。表3嬰幼兒配方乳粉原輔料空氣樣品和表面涂抹樣品采集地區見嬰幼兒配方乳粉加工流程圖圖1，共6個采樣地區，包括5個室內地區以及1個室外地區。其中室內地區涵蓋了嬰幼兒配方乳粉加工過程的主要環節，包括前處理環節(A)、生產環節(B)、生產內包環節(C)、包裝內包環節(D)、包裝環節(E)；室外地區(F)作為參考地點。在2014年11月和2015年6月，每個月進行三次樣品采集，每次取樣時間間隔為10天。經過2個月6次的樣品采集，收集了14類，共84份嬰幼兒配方乳粉原輔料，詳細信息見表3。針對粉狀樣品(α-乳白蛋白、乳清粉、酪蛋白磷酸肽、碳酸鈣、營養素、乳糖、氯化鉀、維生素、核苷酸、礦物質、低聚果糖和乳鐵蛋白)，每類原輔料無菌采集約200g；針對液體樣品(原料乳和棕櫚油)，每類原輔料無菌采集約200mL。收集到的原輔料立即放在低溫采樣箱中保存。表面涂抹樣本采集：利用被無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)潤濕的無菌棉簽涂抹6個不同地區的待檢區域表面(包括儀器設備、人員手、衣服、鞋底以及地面)，面積大小約為30m2，采集完畢后，放入到盛有PBS的15mL離心管中，4℃保存。實施例2細菌的分離：原輔料樣品分別稱取25g嬰幼兒配方乳粉原輔料樣品于滅菌后的225mLBPW三角瓶中，充分混合，取1mL混合液加入到9mL無菌PBS中，混勻后取1mL加入到另一9mL無菌PBS中，以此類推進行梯度稀釋，選擇合適的稀釋梯度，每個稀釋梯度分別吸取100μL混液均勻涂布于TSA固體培養基上，每個樣品3個平行，于37℃恒溫培養箱中培養24h，選取表觀形態不同的單一菌落于LB液體培養基中，混勻后于37℃培養箱中培養24h。針對非單一菌落需進行純化處理，首先用接菌環蘸取震蕩后的過夜培養的LB菌液，在TSA固體培養基上進行三區劃線，37℃倒置培養24h。然后挑取單菌落，重新置于液體LB培養基中進行純培養，連續傳代2次后進行后續試驗。表面涂抹樣品取出4℃下保存的表面涂抹樣品，渦旋混勻，經無菌PBS進行梯度稀釋，選擇合適的稀釋梯度，每個稀釋梯度吸取100μL的稀釋液均勻涂布于TSA固體培養基上，每個樣品3個平行，然后放置于37℃恒溫培養箱中培養24h，選取表觀形態不同的單一菌落于LB液體培養基中，震蕩混勻后于37℃培養箱中過夜培養。非單一菌落的純化方式同上，選擇混濁的培養基進行后續實驗。收集的14類，共84份嬰幼兒配方乳粉原輔料，經前期適當稀釋、培養，挑取固體培養基TSA上菌落形態不同的單一菌落后，進一步分離、純化處理，共分離出56株，其中冬季分離出36株，主要是原料乳中11株、乳清粉中8株、礦物質中3株、α-乳白蛋白中4株、酪蛋白磷酸肽中2株、碳酸鈣中3株、營養素中3株和核苷酸中2株；夏季分離出20株，包括原料乳中7株、乳清粉中3株、營養素中3株、α-乳白蛋白中4株、酪蛋白磷酸肽和核苷酸中各2株。實施例3細菌鑒定：基因組DNA提取對于嬰幼兒配方乳粉原輔料樣品以及表面涂抹樣品，分別取2mL分離菌株的LB液體菌液，按照TIANamp細菌基因組DNA提取試劑盒要求的具體方法對分離菌株進行DNA的提取。利用細菌基因組DNA提取試劑盒對分離的細菌進行DNA提取，并在1％的瓊脂糖凝膠電泳上檢測，部分結果如圖2所示。從圖中可以看到，提取的分離菌株DNA只有一條清晰的條帶，沒有其他雜帶干擾，說明DNA的提本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種嬰幼兒配方乳粉中細菌的溯源方法，其特征在于：步驟如下：(1)對嬰幼兒配方乳粉原輔料、生產環境中的細菌進行分離；(2)對分離菌株進行DNA的提取；(3)利用通用引物FA?27F：5'?AGTCTCTGATCATGCCTCAG?3'和RA?1492R：5'?AAGGAGGTGCTCCAGCC?3'，進行16S?rDNA序列的PCR擴增，擴增產物在1％的瓊脂糖凝膠電泳上進行檢測；(4)對步驟(3)16S?rDNA序列PCR擴增產物進行測序；(5)將獲得菌株的16S?rRNA基因序列利用DNAStar中的MEGA軟件構建系統發育樹，通過發育樹分析達到對嬰幼兒配方乳粉中的細菌進行溯源的目的。

【技術特征摘要】
1.一種嬰幼兒配方乳粉中細菌的溯源方法，其特征在于：步驟如下：(1)對嬰幼兒配方乳粉原輔料、生產環境中的細菌進行分離；(2)對分離菌株進行DNA的提取；(3)利用通用引物FA-27F：5'-AGTCTCTGATCATGCCTCAG-3'和RA-1492R：5'-AAGGAGGTGCTCCAGCC-3'，進行16SrDNA序列的PCR擴增，擴增產物在1％的瓊脂糖凝膠電泳上進行檢測；(4)對步驟(3)16SrDNA序列PCR擴增產物進行測序；(5)將獲得菌株的16SrRNA基因序列利用DNAStar中的MEGA軟件構建系統發育樹，通過發育樹分析達到對嬰幼兒配方乳粉中的細菌進行溯源的目的。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述原輔料、生產環境中的細菌來源于原輔料、生產環境空氣、生產環境表面，所述分離為富集培養分離。...

【專利技術屬性】
技術研發人員：姜毓君，滿朝新，婁彬彬，潘瑞麗，周彥宏，
申請(專利權)人：東北農業大學，
類型：發明
國別省市：黑龍江;23