一種重組質粒、其構建的重組瘧原蟲及其應用制造技術

本發明專利技術涉及腫瘤的細胞免疫治療領域，尤其涉及一種重組質粒、其構建的重組瘧原蟲及其應用，所述重組質粒為在pL0017質粒中插入肝臟腫瘤特異性抗原基因，本發明專利技術還提供一種重組瘧原蟲，其包括所述重組質粒。所述重組瘧原蟲與質粒DNA和RNA載體比較，能夠伴隨瘧原蟲的增殖實現體內的大量擴增，有利于抗原在體內的增加。與缺陷病毒和細菌載體比較，其在機體紅細胞內存活的時間較長，不會短期內被機體免疫系統清除，能夠長期有效表達外源性腫瘤抗原，有利于抗原的長期存在與免疫刺激。所述重組瘧原蟲能夠激活體內Th1相關細胞因子的高表達以及提高CD8α+DCs在總CD11c+DCs中的比例，進一步激活針對腫瘤抗原的特異性細胞毒性T淋巴細胞反應產生，這有利于疫苗的抗腫瘤效果。

Recombinant plasmid, recombinant Plasmodium constructed thereby and application thereof

The invention relates to the field of immunotherapy of tumors, especially relates to a recombinant plasmid of recombinant Plasmodium, the construction and application of the recombinant plasmid was inserted into the liver tumor specific antigen gene in plasmid pL0017, the invention also provides a recombinant Plasmodium, which comprises the recombinant plasmid. Compared with the plasmid DNA and the RNA vector, the recombinant Plasmodium can be accompanied with the proliferation of Plasmodium and achieve a large amount of amplification in vivo, which is beneficial to the increase of antigen in vivo. And compared with the bacterial vector defective virus, its survival in the body of red blood cells in the short term will not be a long time, the immune system, the long-term effective expression of exogenous tumor antigen, has existed for a long time to antigens and immune stimulation. The high expression of the recombinant Plasmodium can activate Th1 related cytokines and increase the proportion of CD8 in total +DCs alpha CD11c+DCs, further activation of specific cytotoxic T lymphocyte response to tumor antigen, which is conducive to the antitumor effect of vaccine.

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】一種重組質粒、其構建的重組瘧原蟲及其應用
本專利技術涉及腫瘤的細胞免疫治療領域，尤其涉及一種重組質粒、其構建的重組瘧原蟲及其應用，具體為以重組質粒為基礎的重組瘧原蟲的構建及其在抗肝臟腫瘤治療中的應用。
技術介紹
肝細胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)，占原發性肝癌比例的85％到90％。它是世界常見的五大癌癥之一，致死率在所有腫瘤中排名前三。數據顯示全球每年新增肝癌患者782,500例，同時每年有745,500例患者死于肝癌。目前，臨床用于肝癌治療的技術包括手術切除、原位肝移植、肝動脈化療栓塞術和局部射頻治療等，這些方法對早期HCC患者有一定療效。但病人往往發現過晚，50％的肝癌患者并不適合使用這些傳統方法。同時，患者一年期存活率低于50％。傳統治療手段的缺陷多，包括切除不完全、毒副作用大、易復發等。另外，靶向治療肝臟腫瘤的藥物，包括Sorafenib和Bevacizumab等，也存在治療副作用和患者生存期短等問題。因此，研發新的治療肝臟腫瘤的藥物是十分迫切需求的。目前，生物免疫治療是一種被廣泛認可和有前途的腫瘤治療手段，大部分手段主要通過激活患者體內特異性CD8+T淋巴細胞來殺死腫瘤細胞。過繼性治療包括chimericantigenreceptorTcells(CAR-T)治療被廣泛研究與參與臨床應用，然而這種針對個人的治療方式花費的時間和金錢都十分巨大，并不是所有人都能接受的。目前，通過載體表達腫瘤特異性抗原，并激活體內特異性細胞免疫來對抗腫瘤生長的方法被認為是一個可行廉價的途徑，其中包括了腫瘤疫苗。在肝臟腫瘤疫苗研究方面，由AFP(alphafetalprotein，甲胎蛋白)的DC(dendriticcell，樹突狀細胞)疫苗與GPC3多肽疫苗都完成了臨床II期，生存率都有顯著提高，這種提高和細胞特異性毒性T淋巴細胞(cytotoxicT-lymphocyte，CTL)反應有顯著關聯。更多關于肝癌的腫瘤疫苗在DNA疫苗、多肽疫苗和DC疫苗上都取得很大進步。然而，這些疫苗也存在一個普遍的問題，就是所引起的針對肝臟腫瘤抗原的細胞免疫很強烈但不具備特異免疫激活的持續性，而選擇一種好的腫瘤抗原載體也許能很好的解決這個問題。HCC特異性抗原被廣泛的發現和用于腫瘤的免疫治療。其中包括磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白(glypican3，GPC3)，它是Pilia等通過對1例過度生長綜合征患者的研究發現的。GPC3在肝癌組織中高表達，而在正常肝組織不表達，是一種新的肝細胞癌的癌胚抗原。研究表明GPC3蛋白能夠激活包括人體和小鼠體內的針對GPC3的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxicT-lymphocyte，CTL)，而不引起自身免疫，這種CTL往往參與針對腫瘤細胞的靶向殺傷反應。針對GPC3的抗體，多肽疫苗以及CAR-T治療已經進入了深入的研究，其中GPC3多肽疫苗已經完成臨床II期，其總體生存率與機體內激活的GPC3特異性免疫反應有顯著關聯。一個基于抗原激活體內免疫系統的腫瘤免疫治療，往往需要一個良好的表達載體。其中應用比較多的載體包括質粒DNA、RNA、缺陷病毒和細菌。它們能夠激活體內強的免疫反應但并不持久，這可能與機體免疫清除和它們不能持續在體內復制存在有關。一個良好的抗原表達載體應該包括以下兩個能力：一是激活體內的針對抗原的強有力特異性CTL反應；二是這種特異性CTL反應能夠在體內持續的存在和發揮腫瘤殺傷作用。大量研究表明，一些病毒或細菌感染能夠很好地抑制腫瘤生長。同時，原生動物被用于腫瘤治療也被廣泛的研究，包括弓形蟲和錐形蟲。同時，瘧原蟲能激活很強烈的體內天然免疫反應。瘧原蟲可作為一種天然佐劑，其本身的一些成份如GPI(glycosylphosphatidylinositolanchors)、基因組DNA和瘧色素能作為病原體相關模式分子(pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs)被機體免疫系統立即識別，并立即激活體內的巨噬細胞、DCs、naturalkiller(NK)細胞、γδT細胞、naturalkillerT(NKT)細胞、CD4+T和CD8+T細胞。而我們推斷這些激活的天然和獲得性免疫可用于抑制腫瘤的生長。我們在此提出利用瘧原蟲作為HCC的免疫治療載體是有一定的依據的：1，瘧原蟲感染能夠激活體內的Th1反應，它對于激活針對腫瘤抗原的CTL至關重要；2，雖然紅細胞缺乏主要組織相容性抗原I(majorhistocompatibilitycomplexclassI，MHCI)，這并不影響它產生針對腫瘤抗原的CTL反應，研究表明DCs和巨噬細胞都參與和激活體內針對瘧原蟲抗原的CTL反應；3，瘧原蟲本身寄生在體內的紅細胞中，它能夠長期的存在于體內，這有利于抗原的長期表達和釋放，長久地激活體內的CTL反應。CN101838611A公開了一種表達外源基因的重組瘧原蟲，該重組瘧原蟲中的外源基因包括抗原基因、治療基因、免疫調節劑基因或肽基因，其中該專利技術采用的質粒為pL0015質粒，pL0015質粒主要使用的是單酶切(BamHI)插入目的基因，這在插入目的基因時，容易出現目的基因的反向插入，不利于質粒載體的構建，且該專利中的重組瘧原蟲不能同時表達多個外源基因，且表達的基因無法分泌到瘧原蟲蟲體外。
技術實現思路
針對目前存在的問題，本專利技術提供一種重組質粒、其構建的重組瘧原蟲及其應用，所采用的pL0017質粒使用的是雙酶切法(BamHI/XbaI)插入目的基因，不存在質粒構建中的基因反向插入和再次測序鑒定等繁雜手段，同時引入一個新的伯氏瘧原蟲延伸因子(EF)-1α啟動子可以同時表達兩個甚至兩個以上的外源基因。為達此目的，本專利技術采用以下技術方案：一方面，本專利技術提供一種重組質粒，所述重組質粒為在pL0017質粒中插入肝臟腫瘤特異抗原基因。本專利技術中，選用pL0017質粒使用的是雙酶切法(BamHI/XbaI)插入目的基因，這樣就不存在質粒構建中的基因反向插入和再次測序鑒定等繁雜手段。根據本專利技術，所述肝臟腫瘤特異抗原基因為gpc3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3表達基因)、甲胚蛋白AFP表達基因、MAGE表達基因或NY-ESO-1表達基因中的任意一種或至少兩種的組合，優選為gpc3抗原基因，所述gpc3表達的GPC3蛋白是一個免疫原性很強的肝臟腫瘤抗原，針對GPC3的抗體，多肽疫苗以及CAR-T治療已經進入了深入的研究，其中GPC3多肽疫苗已經完成臨床II期，其總體生存率與機體內激活的GPC3特異性免疫反應有顯著關聯。根據本專利技術，在pL0017質粒原有的基礎上進行改造，插入一個新的獨立的基因功能表達元件，它包括了新的啟動子，目的基因開放閱讀框插入位點以及終止子，所述重組質粒中的新的啟動子為伯氏瘧原蟲的全蟲期表達的啟動子pbeef1aα(伯氏瘧原蟲延伸因子(EF)-1α啟動子)，新的終止子為3’UTR，所述重組質粒目的基因開放閱讀框插入位點為本質粒上單一酶切位點NotI和ClaI。本專利技術中，所述啟動子pbeef1αa能夠啟動下游基因在瘧原蟲的整個生命周期中強表達，能夠持續表達引入的GPC3蛋白。同時，由于改造后的質粒包含2個獨立的基因表達元件，這使重組蟲株可以同本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種重組質粒，其特征在于，所述重組質粒為在pL0017質粒中插入肝臟腫瘤特異抗原基因。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】1.一種重組質粒，其特征在于，所述重組質粒為在pL0017質粒中插入肝臟腫瘤特異抗原基因。2.根據權利要求1所述的重組質粒，其特征在于，所述肝臟腫瘤特異抗原基因為磷脂酰肌醇蛋白聚糖3表達基因gpc3、甲胚蛋白AFP表達基因、MAGE表達基因或NY-ESO-1表達基因中的任意一種或至少兩種的組合，優選為磷脂酰肌醇蛋白聚糖3表達基因gpc3；優選地，所述重組質粒還包括伯氏瘧原蟲的全蟲期表達的啟動子pbeef1aα和終止子3’UTR；優選地，所述重組質粒還包括酶切位點NotI和ClaI。3.根據權利要求1或2所述的重組質粒，其特征在于，所述重組質粒的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.根據權利要求1-3中任一項所述的重組質粒，其特征在于，所述重組質粒同時表達2個或2個以上外源基因。5.一種重組瘧原蟲，其特征在于，所述重組瘧原蟲包括如權利要求1-4中任一項所述的重組質粒。6.根據權利要求5所述的重組瘧原蟲，其特征在于，所述重組瘧原蟲還包括綠色熒光蛋白GFP與海腎...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳小平，秦莉，劉權，
申請(專利權)人：廣州中科藍華生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東,44