用于獲得Nrf1D蛋白抗體的免疫原、Nrf1D蛋白抗體及Elisa檢測試劑盒制造技術

本發(fā)明專利技術提供用于獲得Nrf1D蛋白抗體的免疫原、Nrf1D蛋白抗體及Elisa檢測試劑盒，所述免疫原為先合成氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的多肽，以Sulfo?SMCC為偶聯(lián)劑，將所述多肽與玥孔戚血藍蛋白偶聯(lián)得到；所述抗體以所述免疫原為抗原，將所述抗原用弗氏完全佐劑乳化后免疫新西蘭白兔，取免疫后的新西蘭白兔血進行離心，收集離心后的上清液獲得；所述Elisa檢測試劑盒組分包括酶標板、包被液、封閉液、酶標二抗、TMB顯色液、終止液、檢測抗原和所述Nrf1D蛋白抗體，所述檢測抗原為合成氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的多肽，以戊二醛為偶聯(lián)劑，將所述多肽與牛血清白蛋白偶聯(lián)獲得。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
用于獲得Nrf1D蛋白抗體的免疫原、Nrf1D蛋白抗體及Elisa檢測試劑盒
本專利技術屬于抗體
，具體涉及用于獲得Nrf1D蛋白抗體的免疫原、Nrf1D蛋白抗體及Elisa檢測試劑盒。
技術介紹
CNC-bZIP是bZIP轉錄因子的一個亞家族，該亞家族以一個大約40個氨基酸同源域為其特征，該區(qū)域與N末端的堿性亮氨酸拉鏈區(qū)域緊鄰。從進化角度來看，具有這個同源域的蛋白在秀麗隱桿線蟲(Skn1)、黑腹果蠅(cap‘n’collar)、雞(ECH)[63]、小鼠(Bach)和人的發(fā)育過程中，都有廣泛的參與。在人體內，目前已知的三個成員(NF-E2、TCF11/LCR-F1/Nrf1和Nrf2)以及它們在鼠科動物體內的同源蛋白都已在證明導致β球蛋白基因位點的譜系特異性表達機制的過程中被分離并鑒定。然而，只有NF-E2才有細胞類型的特異性，Nrf1和Nrf2均沒有。相應敲除小鼠的數(shù)據(jù)和之前的研究(Nrf1結合位點在紅色的膽色素原脫氨酶基因、血紅素加氧酶1(HO1)基因和NAD(P)H:醌氧化還原酶的表達中起著重要的作用)均表明，這些因子廣泛的參與哺乳動物的基因調控。研究發(fā)現(xiàn)：啟動子元件和轉錄因子參與小鼠肥大細胞系CPII(用IgE+抗原(Ag)刺激)和小鼠胎兒樹突狀細胞系DC18(用IgG+Ag刺激)對TNFα的感應。在肥大細胞中，IgE+Ag響應元件被映射到一個與轉錄因子AP1和NF-ATP1和NF-AT(延伸的κ3/AP1+位點ATGAGCTCATGGGTTTCTCCACCACCAA；黑體部分是AP1和NF-AT位點)相互作用的28bp寡核苷酸上。在小鼠樹突狀細胞系DC18中，做相應的分析，發(fā)現(xiàn)了一個類似的位點(GAGCTCATGGGTTTCTCCACCAA，延伸的κ3/AP1-位點)，這個位點的5′2nt(AT)更短，因此該位點刪除了AP1結合位點。在該細胞系中，可以觀察到結合這個探針的Nrf1，而在肥大細胞中，使用凝膠轉移分析法觀察不到任何轉錄因子與該探針的相互作用。這種差異在功能上受到報告基因載體的5’啟動子缺失的支持，該啟動子被證明是完整AP1位點的誘導所必需的，但這僅限于肥大細胞而對樹突狀細胞無效。研究發(fā)現(xiàn)，收到IgE+Ag刺激后，在肥大細胞TNFα啟動子的AP1復合體中，發(fā)現(xiàn)了與幾種經(jīng)典的AP1轉錄因子(c-jun、junD、fosB和ATF2)結合在一起的Nrf1或與其緊密相關的因子。使用PCR檢測/克隆技術，在該細胞系中，已鑒定出Nrf1的六種剪接突變體。其中有幾種刪除了之前假定的起始和終止密碼子；有些剪接突變體，例如Nrf1D，包含一個在bZIP區(qū)域發(fā)生改變的C末端，這導致了終止子的缺失。這個被改變的亮氨酸拉鏈區(qū)的表達干擾了TNFα對轉錄過程的誘導作用，這表明，該剪接變體確實能與活化的AP1/NF-AT復合物相互作用。但是目前面臨最大的問題是尚未有合適的試劑能檢測Nrf1D蛋白的表達情況。
技術實現(xiàn)思路
針對現(xiàn)有技術存在的上述不足，本專利技術要解決的技術問題是：針對現(xiàn)有技術中沒有能夠檢測Nrf1D蛋白表達情況的抗體和相關檢測試劑盒，而提供用于獲得Nrf1D蛋白抗體的免疫原、Nrf1D蛋白抗體及Elisa檢測試劑盒。為了解決上述技術問題，本專利技術采用如下技術方案：用于獲得Nrf1D蛋白抗體的免疫原，合成氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的多肽，以Sulfo-SMCC為偶聯(lián)劑，將所述多肽與玥孔戚血藍蛋白偶聯(lián)，得到所述用于獲得Nrf1D蛋白抗體的免疫原。進一步，以所述免疫原為抗原，將所述抗原用弗氏完全佐劑乳化后免疫新西蘭白兔，取免疫后的新西蘭白兔血進行離心，收集離心后的上清液，獲得Nrf1D蛋白粗抗體。進一步，將所述抗原用弗氏完全佐劑乳化后分別于第1天、第15天、第29天、第43天和第53天免疫新西蘭白兔，獲得Nrf1D蛋白粗抗體。作為優(yōu)化，將所述抗原用弗氏完全佐劑乳化后頸背部皮下注射免疫新西蘭白兔，每只新西蘭白兔至少頸背部皮下注射8點進行免疫。作為優(yōu)化，對所述Nrf1D蛋白粗抗體進行純化，獲得所述Nrf1D蛋白抗體；所述純化包括如下步驟：將氨基酸序列如SEQIDNO.1的多肽連接到活化的SulfolinkResin上，制備抗原親和柱，用PBS緩沖液對所述抗原親和柱進行平衡，將過濾后的Nrf1D蛋白粗抗體過平衡處理后的抗原親和柱，而后用PBS緩沖液再次進行柱平衡，最后用抗體洗脫液對抗原親和柱進行洗脫，對洗脫液于280nm處進行吸光度檢測，合并收集吸光度大于1.0的洗脫液并以PBS緩沖液為透析液進行透析，獲得所述Nrf1D蛋白抗體；其中，所述抗體洗脫液為pH2.7、濃度為0.075g/mL的甘氨酸水溶液。用于檢測Nrf1D蛋白的Elisa檢測試劑盒，其組分包括酶標板、包被液、封閉液、酶標二抗、TMB顯色液和終止液，其組分還包括檢測抗原和所述Nrf1D蛋白抗體；其中，所述檢測抗原采用如下方法獲得：合成氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的多肽，以戊二醛為偶聯(lián)劑，將所述多肽與牛血清白蛋白偶聯(lián)，獲得所述檢測抗原。作為優(yōu)化，所述包被液為碳酸鈉和碳酸氫鈉的混合水溶液，所述包被液的pH為9.6。作為優(yōu)化，所述封閉液由脫脂奶粉溶解于PBS緩沖液中獲得。作為優(yōu)化，所述終止液為2mol/L的硫酸水溶液。作為優(yōu)化，所述酶標二抗為酶標羊抗兔二抗。相比現(xiàn)有技術，本專利技術具有如下有益效果：1、本專利技術選擇Nrf1D的C端氨基酸序列合成多肽作為抗原，并以該抗原免疫兔獲得本專利技術抗體，本專利技術獲得的抗體能夠特異性識別Nrf1D蛋白，氨基酸序列經(jīng)過NCBIblast驗證也僅只一致于該蛋白。2、本專利技術還提供了一種用于檢測Nrf1D蛋白的Elisa檢測試劑盒，該試劑盒對Nrf1D蛋白具有特異性識別能力，能夠檢測樣品中Nrf1D蛋白的表達情況。3、本專利技術還經(jīng)過蛋白westernblotting實驗對抗體進行驗證，結果顯示本專利技術Nrf1D蛋白抗體的特異性以及靈敏性都極高。4、本專利技術抗體可以用來診斷、預防和/或治療個體，如：人患者體內一種或多種與Nrf1、Nrf1D相關病癥；以及可以用于調節(jié)有Nrf1D介導的抗氧化、抗炎癥、蛋白酶體功能和調控糖脂代謝平衡反應中的用途。附圖說明圖1為Nrf1D蛋白抗體的westernblotting試驗實驗組檢測圖。圖2為Nrf1D蛋白抗體的westernblotting試驗對照組檢測圖。具體實施方式下面結合具體實施例對本專利技術作進一步詳細說明。本實施案例在以本專利技術技術為前提下進行實施，現(xiàn)給出詳細的實施方式和具體的操作過程來說明本專利技術具有創(chuàng)造性，但本專利技術的保護范圍不限于以下的實施例。一、實驗材料1、主要試劑:Sulfo-SMCC、KLH、SulfolinkResin為美國Pierce公司產(chǎn)品，福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑為美國Sigma公司。NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、Tris、Glycine、EDTA、TMB、DMSO、戊二醛等為國產(chǎn)分析純試劑。2、耗材：透析袋為美國Viskase公司產(chǎn)品，截留分子量14kD。P-10柱為美國BioRad公司產(chǎn)品。3、儀器：磁力攪拌器（上海梅穎浦），旋轉混合器（上海強運），紫外/可見光分光光度計（上海奧普勒），高速離心機（日立）4、溶液配置：1、本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
用于獲得Nrf1D蛋白抗體的免疫原，其特征在于，合成氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的多肽，以Sulfo?SMCC為偶聯(lián)劑，將所述多肽與玥孔戚血藍蛋白偶聯(lián)，得到所述用于獲得Nrf1D蛋白抗體的免疫原。

【技術特征摘要】
1.用于獲得Nrf1D蛋白抗體的免疫原，其特征在于，合成氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的多肽，以Sulfo-SMCC為偶聯(lián)劑，將所述多肽與玥孔戚血藍蛋白偶聯(lián)，得到所述用于獲得Nrf1D蛋白抗體的免疫原。2.Nrf1D蛋白抗體，其特征在于，以權利要求1所述免疫原為抗原，將所述抗原用弗氏完全佐劑乳化后免疫新西蘭白兔，取免疫后的新西蘭白兔血進行離心，收集離心后的上清液，獲得Nrf1D蛋白粗抗體。3.根據(jù)權利要求2所述Nrf1D蛋白抗體，其特征在于，將所述抗原用弗氏完全佐劑乳化后分別于第1天、第15天、第29天、第43天和第53天免疫新西蘭白兔，獲得Nrf1D蛋白粗抗體。4.根據(jù)權利要求2所述Nrf1D蛋白抗體，其特征在于，將所述抗原用弗氏完全佐劑乳化后頸背部皮下注射免疫新西蘭白兔，每只新西蘭白兔至少頸背部皮下注射8點進行免疫。5.根據(jù)權利要求2所述Nrf1D蛋白抗體，其特征在于，對所述Nrf1D蛋白粗抗體進行純化，獲得所述Nrf1D蛋白抗體；所述純化包括如下步驟：將氨基酸序列如SEQIDNO.1的多肽連接到活化的SulfolinkResin上，制備抗原親和柱，用PBS緩沖液對所述抗原親和柱進行平衡，將過濾后的Nrf1D蛋白粗抗體過平...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：張義國，汪紅霞，
申請(專利權)人：重慶大學，
類型：發(fā)明
國別省市：重慶,50