一種微生物生產氨基羥基苯蟻酸的方法技術

一種微生物生產氨基羥基苯蟻酸的方法，具體是一種青霉生物催化制備醫藥中間體2?氨基?3?羥基?苯蟻酸的方法，微生物發酵液中加入底物，進行生物催化反應，產品收率高，反應條件溫和，常溫、常壓操作，解決了現有方法生產條件苛刻的困難。

A method for the microbial production of amino hydroxy benzene formic acid

A method for the microbial production of amino hydroxy benzene carboxylic acid, in particular to a method for Penicillium biocatalytic preparation of pharmaceutical intermediates 2 amino 3 hydroxy benzene carboxylic acid, adding substrate in fermentation liquid, bio catalytic reaction, high yield, mild reaction conditions, ambient temperature and pressure, the method to solve the existing the production of the harsh conditions of the difficulties.

【技術實現步驟摘要】
一種微生物生產氨基羥基苯蟻酸的方法
本專利技術屬于制藥工程
，特別涉及到青霉生物催化制備醫藥中間體2-氨基-3-羥基-苯蟻酸的技術。
技術介紹
生物催化具有催化效率高、選擇性強、條件溫和、環境友好等突出優點,是可持續發展過程中替代和拓展傳統有機化學合成的重要方法。其中微生物催化是生物催化最具吸引力的應用領域之一,在工業生物催化中一直扮演著重要角色。芳烴的羧化反應是一類重要的反應，其產物為芳烴羥基羧酸，是重要的藥物合成起始原料。但是，現在的生產采用傳統的化學合成，用芳烴與CO2反應，反應壓力高達10MPa，溫度高達140-380℃，反應選擇性差，副產物多。采用微生物催化，則可能改變這種狀況。采用微生物催化，可以在常溫、常壓下反應生產芳烴羥基羧酸，條件溫和，選擇性高，副反應少，產率高。本專利技術將采用微生物催化反應，生產芳烴羥基羧酸：2-氨基-3-羥基-苯蟻酸。
技術實現思路
本專利技術采用青霉催化制備2-氨基-3-羥基-苯蟻酸，反應式如下：底物2-氨基酚（1）經青霉催化反應，得到產物2-氨基-3-羥基-苯蟻酸（2）。有多種微生物可以催化此反應，經過大量實驗篩選，最終確定采用青霉作為催化劑，因為其催化反應的效果最好，副產物極少，反應收率高。許多霉菌都可以進行生物催化此反應，然而，其效果不同，相差很大，經實驗，本專利技術選用青霉菌株為CBS209.28，其催化反應效果最佳。由于底物溶解度較低，所以，加入表面活性劑以增加底物的溶解度。盡管表面活性劑增加了底物溶解度，底物仍然不能很好溶解，屬于液-液2相反應，底物、產物的相間傳質為反應的限制環節，所以，還需采取措施，以提高反應速度。增加非均相反應的反應界面，是提高非均相反應的有效措施之一。加入表面活性劑后，在強烈攪拌下，反應液成為乳液，使得催化反應界面大幅度增加，從而大幅度提高反應速度。特別是，加入的表面活性劑，必須生物相容，不抑制微生物的催化活性，所以，表面活性劑種類和濃度的選擇，是非常重要的。大量實驗表明，對于本反應，加入直鏈的10碳醇聚氧乙烯醚為10-12g/L是最佳的。反應結束后，用有機溶劑萃取產物。需要破乳，有多種方法可以破乳，包括鹽析法：加入氯化鈉、硫酸銨或氯化鈣、氯化鎂、硫酸鈣、硫酸鎂；凝聚法：加入聚合氯化鋁、明礬等；或者將上述2類混合加入；加熱等。不同產物，所用的方法不同，實驗表明，對于本反應，加入1.5%的硫酸鈣+0.06%的聚合氯化鋁是最佳的。羧化反應中，采用NaHCO3提供CO2,實際上，有多種物質可以提供CO2,但是，通過大量實驗，結果表明，對于本專利技術，使用NaHCO3是最佳的。由于加入NaHCO3會使反應液的pH升高，而適宜的pH，對微生物催化反應致關重要，所以，不能一次加入，必須采用流加方式加入NaHCO3。然而，即使流加NaHCO3，反應液的pH仍然升高，所以，還必須采取措施，維持反應液處于適宜的pH，使微生物能夠正常發揮生物催化作用。通過大量實驗表明，流加鹽酸水溶液是適宜的方法，調節NaHCO3與鹽酸水溶液的流加速率，可以使溶液的pH處于最佳范圍，使生物催化反應正常進行。可以明顯看出，本專利技術所涉及的微生物菌株選擇、表面活性劑選擇、破乳劑選擇、CO2供體選擇，還有反應溫度，反應時間，反應pH，底物濃度，生物催化反應液成分確定等，眾多因素均需考慮，并且，它們相互影響。特別是，需要從實驗室小試、中試，直到工業規模反應，更是大幅度增加了工作難度、工作量。所以，實驗設計至管重要，如此多的因素，生物催化反應動力學理論分析和實驗工作量巨大。培養介質：1、種子培養基成份為:酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，麥芽浸膏25-30g，硫酸銨0.5-0.7g/L;配制固體培養基時添加15g/L的瓊脂粉。2、培養液成份：玉米漿(以干物質計)含量為27-31g/L，酵母浸膏9-11g/L，葡萄糖20-24g/L，麥芽浸膏15-18g，硫酸銨0.5-0.7g/L，硫酸鎂0.3-0.4g/L，磷酸二氧鉀1.8-2.3g/L，碳酸鈣0.7g/L,硫酸亞鐵0.18g/L,硫酸錳0.025g/L;pH6.4。2、固體培養基成份：在液體培養基中加入2%的瓊脂粉。微生物發酵液制備。青霉CBS209.28經斜面、搖瓶、種子罐培養得到種子液；發酵罐加入培養液，裝料系數為0.6-0.7，121℃高壓滅菌30分鐘冷卻至30-31℃，將青霉菌種子液接種至發酵罐，接種比例為8-9％，通氣比為1-1.2V/V30-31℃培養42-46小時，發酵液中濕酵母細胞濃度為95-98g/L，此發酵液用作生物催化反應催化劑。用HPLC測產品收率及純度，C18柱，紫外檢測器，波長254nm，流動相為pH3的磷酸緩沖液：甲醇=90:10。生物催化反應：發酵罐,即制備微生物發酵液發酵罐，在其發酵液中加入底物2-氨基酚，使濃度為90-95g/L，補加以下成份，使濃度為：直鏈的10碳醇聚氧乙烯醚為10-12g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、糯米粉18-22g/L，121℃高壓滅菌30分鐘；冷卻至33-35℃時，攪拌乳化，進行生物催化反應，反應時間為49-54小時；反應開始時，立即流加濃度為5％的NaHCO3水溶液，同時流加濃度為1％的鹽酸水溶液，調節NaHCO3與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.4-6.6，所加入的物料均經過滅菌處理；通氣比為0.6-0.7V/V,即每分鐘通氣量為0.6-0.7倍反應液體積，反應結束后，破乳，用0.2倍反應液體積乙酸乙酯萃取反應液萃取3次，合并有機相，有機相蒸出乙酸乙酯，得到產物2-氨基-3-羥基-苯蟻酸，反應轉化率98.1-99.6％，產品收率95.9-97.1％。具體實施方式實施例1培養液成份：玉米漿(以干物質計)含量為27-31g/L，酵母浸膏9-11g/L，葡萄糖20-24g/L，麥芽浸膏15-18g，硫酸銨0.5-0.7g/L，硫酸鎂0.3-0.4g/L，磷酸二氧鉀1.8-2.3g/L，碳酸鈣0.7g/L,硫酸亞鐵0.18g/L,硫酸錳0.025g/L;pH6.4。微生物發酵液制備。青霉CBS209.28經斜面、搖瓶、種子罐培養得到種子液；發酵罐加入培養液，裝料系數為0.6-0.7，121℃高壓滅菌30分鐘冷卻至30-31℃，將青霉菌種子液接種至發酵罐，接種比例為8-9％，通氣比為1-1.2V/V30-31℃培養42-46小時，發酵液中濕酵母細胞濃度為95-98g/L，此發酵液用作生物催化反應催化劑。生物催化反應：15L發酵罐,即制備微生物發酵液發酵罐，在其發酵液中加入底物2-氨基酚，使濃度為90-95g/L，補加以下成份，使濃度為：直鏈的10碳醇聚氧乙烯醚為10-12g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、糯米粉18-22g/L，121℃高壓滅菌30分鐘；冷卻至33-35℃時，攪拌乳化，進行生物催化反應，反應時間為49-54小時；反應開始時，立即流加濃度為5％的NaHCO3水溶液，同時流加濃度為1％的鹽酸水溶液，調節NaHCO3與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.4-6.6，所加入的物料均經過滅菌處理；通氣比為0.6-0.7V/V,即每分鐘通氣量為0.6-0.7倍反應液體積，反應結束后，破乳，用0.2倍反應液本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種青霉生物催化制備2?氨基?3?羥基?苯蟻酸的方法，其特征在于青霉發酵液中加入底物2?氨基酚，使濃度為90?95g/L，補加以下成份，使濃度為：直鏈的10碳醇聚氧乙烯醚為10?12g/L，木糖20?24g/L、蔗糖25?28g/L、糯米粉18?22?g/L，121℃高壓滅菌30分鐘；冷卻至33?35℃時，攪拌乳化，進行生物催化反應，反應時間為49?54小時；反應開始時，立即流加濃度為5％的NaHCO

【技術特征摘要】
1.一種青霉生物催化制備2-氨基-3-羥基-苯蟻酸的方法，其特征在于青霉發酵液中加入底物2-氨基酚，使濃度為90-95g/L，補加以下成份，使濃度為：直鏈的10碳醇聚氧乙烯醚為10-12g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、糯米粉18-22g/L，121℃高壓滅菌30分鐘；冷卻至33-35℃時，攪拌乳化，進行生物催化反應，反應時間為49-54小時；反應開始時，立即流加濃度為5％的NaHCO3水溶液，同時流加濃度為1％的鹽酸水溶液，調節NaHCO3與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.4-6.6，所加入的物料均經過滅菌處理；通氣比為0.6-0.7V/V?分鐘,即每分鐘通氣量為0.6-0.7倍反應液體積，反應結束后，破乳，用乙酸乙酯萃取反應液，有機相蒸出乙酸乙酯，得到產物2-氨基-3-羥基-苯蟻酸，反應轉化率98.1-...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張媛媛，劉均洪，
申請(專利權)人：青島科技大學，
類型：發明
國別省市：山東,37