用于改善的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的組合物和方法技術(shù)

本公開(kāi)的方面涉及改善來(lái)自宿主細(xì)胞的分泌性銅酶的表達(dá)的方法，其通過(guò)操縱涉及銅在宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)的一種或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)，所述蛋白質(zhì)例如膜結(jié)合的銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶和可溶性銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。本公開(kāi)還提供了包含此類經(jīng)過(guò)改善的宿主細(xì)胞的組合物以及來(lái)源于包含一種或多種感興趣的銅酶的經(jīng)過(guò)改善的宿主細(xì)胞的產(chǎn)物。

Compositions and methods for improved protein production

Aspects of the present disclosure relates to a method of improving the expression from the host cell secretory copper enzyme, its expression level through the manipulation of one or more proteins involved in copper transport of the host cell, the protein such as membrane bound copper transporter ATP enzymes and soluble copper transport protein. The present disclosure also provides compositions comprising such improved host cells and products derived from improved host cells comprising one or more of the copper enzymes of interest.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】用于改善的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的組合物和方法相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求于2014年8月15日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)62/038,095的優(yōu)先權(quán)，其全文以引用方式并入本文。序列表根據(jù)37C.F.R.§1.52(e)通過(guò)EFS提交的序列表以引用方式并入本文。通過(guò)EFS提交的序列表文本文件包含于2015年7月10日創(chuàng)建的、大小為44千字節(jié)的文件“40456-WO-PCT_ST25.txt”。
本公開(kāi)的方面涉及改善來(lái)自宿主細(xì)胞的分泌性銅酶(cuproenzyme)的表達(dá)的方法，其通過(guò)操縱一種或多種銅金屬伴侶蛋白，例如膜結(jié)合的銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶和可溶性銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)。本公開(kāi)還提供包含此類經(jīng)過(guò)改善的宿主細(xì)胞的組合物以及由包含一種或多種感興趣的銅酶的經(jīng)過(guò)改善的宿主細(xì)胞制備的產(chǎn)物。介紹銅是具有氧化還原活性的過(guò)渡金屬，其為多種酶(在本文稱為銅酶)的必需輔因子。然而，由于其毒性，細(xì)胞中游離銅的含量必須保持在低水平。因此，少于總細(xì)胞銅的0.01％在細(xì)胞質(zhì)中是游離的；大多數(shù)銅被金屬硫蛋白所結(jié)合和螯合以防止其細(xì)胞毒性作用。此外，細(xì)胞中的不同區(qū)室具有不同的銅含量，其中線粒體具有比細(xì)胞質(zhì)更高的銅含量，細(xì)胞質(zhì)繼而比高爾基體具有更高的含量。在用于在已工程化以過(guò)表達(dá)一種或多種功能性銅酶的重組宿主細(xì)胞中產(chǎn)生此類酶的工業(yè)環(huán)境中，細(xì)胞中的游離銅的有限可用性是有問(wèn)題的。由于以上指出的細(xì)胞銅梯度，在生產(chǎn)分泌性銅酶時(shí)，這一問(wèn)題尤其明顯。然而，在宿主細(xì)胞培養(yǎng)期間以實(shí)現(xiàn)正確平衡提供額外的銅是一個(gè)相當(dāng)大的技術(shù)挑戰(zhàn)，所述平衡即：促進(jìn)功能性和分泌性銅酶的產(chǎn)生，而不會(huì)變得對(duì)宿主細(xì)胞有毒性。除了與由宿主細(xì)胞產(chǎn)生銅酶相關(guān)的問(wèn)題之外，對(duì)于從工廠排放的廢水中允許的銅含量也有規(guī)定。因此，可向銅酶發(fā)酵過(guò)程添加的銅的量也存在上限。因此，需要研發(fā)重組宿主細(xì)胞和使用此類宿主細(xì)胞來(lái)改善銅酶在發(fā)酵過(guò)程中的產(chǎn)生的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的方面至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：一種或多種銅金屬伴侶蛋白在期望的重組宿主細(xì)胞，例如絲狀真菌宿主細(xì)胞中的增加的表達(dá)可改善分泌性銅酶在宿主細(xì)胞中的產(chǎn)生。因此，本文提供了在基本上相同的培養(yǎng)條件下，與不具有一種或多種銅金屬伴侶蛋白的增加表達(dá)的親本宿主細(xì)胞相比，表現(xiàn)出改善的銅酶產(chǎn)生/分泌的具有一種或多種銅金屬伴侶蛋白的增加表達(dá)的重組宿主細(xì)胞。還提供了由這些宿主細(xì)胞產(chǎn)生銅酶的方法以及包含由此類宿主細(xì)胞產(chǎn)生的銅酶的組合物?？捎糜谥黝}組合物和方法的分泌性銅酶的示例包括但不限于：裂解性多糖單加氧酶(LPMO)、漆酶、酪氨酸酶、胺氧化酶、膽紅素氧化酶、兒茶酚氧化酶、多巴胺β-單加氧酶、半乳糖氧化酶、己糖氧化酶、L-抗壞血酸氧化酶、肽基甘氨酸單加氧酶、多酚氧化酶、槲皮素2,3-雙氧化酶、以及過(guò)氧化物歧化酶。本專利技術(shù)的方面包括但不限于以下：1.一種用于由宿主細(xì)胞產(chǎn)生銅酶的方法，包括：在表達(dá)銅酶的宿主細(xì)胞中過(guò)表達(dá)銅金屬伴侶蛋白，以及在足以產(chǎn)生銅酶的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中當(dāng)在基本上相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時(shí)，與不過(guò)表達(dá)銅金屬伴侶蛋白的相應(yīng)宿主細(xì)胞相比，所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生增大量的銅酶。2.根據(jù)1所述的方法，其中銅酶是從宿主細(xì)胞中分泌的。3.根據(jù)1或2所述的方法，其中銅酶選自由以下項(xiàng)構(gòu)成的組：裂解性多糖單加氧酶(LPMO)、漆酶、酪氨酸酶、胺氧化酶、膽紅素氧化酶、兒茶酚氧化酶、多巴胺β-單加氧酶、半乳糖氧化酶、己糖氧化酶、L-抗壞血酸氧化酶、肽基甘氨酸單加氧酶、多酚氧化酶、槲皮素2,3-雙氧化酶、以及過(guò)氧化物歧化酶。4.根據(jù)以上任一項(xiàng)所述的方法，其中銅酶與宿主細(xì)胞是內(nèi)源的。5.根據(jù)以上任一項(xiàng)所述的方法，其中銅酶與宿主細(xì)胞是異源的。6.根據(jù)以上任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)源自宿主細(xì)胞的啟動(dòng)子控制銅酶和/或銅金屬伴侶蛋白的表達(dá)。7.根據(jù)6所述的方法，其中宿主細(xì)胞為里氏木霉(Trichodermareesei，T.reesei)細(xì)胞，并且啟動(dòng)子為源自里氏木霉的丙酮酸激酶(pki)或纖維二糖水解酶I(cbh1)啟動(dòng)子。8.根據(jù)以上任一項(xiàng)所述的方法，其中宿主細(xì)胞表達(dá)至少一種另外的銅酶，其中在基本上相同的培養(yǎng)條件下，與不過(guò)表達(dá)銅金屬伴侶蛋白的相應(yīng)宿主細(xì)胞相比，至少一種另外的銅酶的產(chǎn)生增加。9.根據(jù)以上任一項(xiàng)所述的方法，其中銅金屬伴侶蛋白為膜結(jié)合的銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶。10.根據(jù)9所述的方法，其中膜結(jié)合的銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶包含與SEQIDNO:6具有至少60％同一性的氨基酸序列。11.根據(jù)9或10所述的方法，其中膜結(jié)合的銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶選自表2。12.根據(jù)1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中銅金屬伴侶蛋白為可溶性銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。13.根據(jù)12所述的方法，其中可溶性銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含與SEQIDNO:3具有至少60％同一性的氨基酸序列。14.根據(jù)12或13所述的方法，其中可溶性銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白選自表1。15.根據(jù)以上任一項(xiàng)所述的方法，還包括在宿主細(xì)胞中過(guò)表達(dá)第二銅金屬伴侶蛋白。16.根據(jù)15所述的方法，其中第一銅金屬伴侶蛋白為包含與SEQIDNO:6具有至少60％同一性的氨基酸序列的膜結(jié)合的銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶并且第二銅金屬伴侶蛋白為包含與SEQIDNO:3具有至少60％同一性的氨基酸序列的可溶性銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。17.根據(jù)以上任一項(xiàng)所述的方法，其中宿主細(xì)胞為絲狀真菌宿主細(xì)胞。18.根據(jù)17所述的方法，其中絲狀真菌宿主選自由以下項(xiàng)構(gòu)成的組：曲霉屬(Aspergillus)、枝頂孢屬(Acremonium)、出芽短梗霉屬(Aureobasidium)、白僵菌屬(Beauveria)、頭孢霉屬(Cephalosporium)、擬蠟菌屬(Ceriporiopsis)、毛殼菌屬(Chaetomium)、擬青霉屬(paecilomyces)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、麥角菌屬(Claviceps)、旋孢腔菌屬(Cochiobolus)、隱球菌屬(Cryptococcus)、黑蛋巢菌屬(Cyathus)、內(nèi)座殼屬(Endothia)、Endothiamucor、鐮孢屬(Fusarium)、粘帚霉屬(Gilocladium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、Magnaporthe、毀絲霉屬(Myceliophthora)、漆斑菌屬(Myrothecium)、毛霉菌屬(Mucor)、脈孢菌屬(Neurospora)、平革菌屬(Phanerochaete)、柄孢殼菌屬(Podospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、梨孢霉屬(Pyricularia)、根毛霉屬(Rhizomucor)、根霉屬(Rhizopus)、裂褶菌屬(Schizophylum)、殼多胞菌屬(Stagonospora)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、木霉屬(Trichoderma)、嗜熱菌屬(Thermomyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、毛癬菌屬(Trichophyton)、栓菌屬(Trametes)、以及側(cè)耳菌屬(Pleurotus)。19.根據(jù)17所述的方法，其中絲狀真菌宿主細(xì)胞為里氏木霉、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、或埃默森籃狀菌(Talaromycesem本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于由宿主細(xì)胞產(chǎn)生銅酶(cuproenzyme)的方法，包括：在表達(dá)銅酶的宿主細(xì)胞中過(guò)表達(dá)銅金屬伴侶蛋白，以及在足以產(chǎn)生所述銅酶的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，其中當(dāng)在基本上相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時(shí)，與不過(guò)表達(dá)所述銅金屬伴侶蛋白的相應(yīng)宿主細(xì)胞相比，所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生增加的量的所述銅酶。

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】2014.08.15 US 62/038,0951.一種用于由宿主細(xì)胞產(chǎn)生銅酶(cuproenzyme)的方法，包括：在表達(dá)銅酶的宿主細(xì)胞中過(guò)表達(dá)銅金屬伴侶蛋白，以及在足以產(chǎn)生所述銅酶的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，其中當(dāng)在基本上相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時(shí)，與不過(guò)表達(dá)所述銅金屬伴侶蛋白的相應(yīng)宿主細(xì)胞相比，所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生增加的量的所述銅酶。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述銅酶是從所述宿主細(xì)胞中分泌的。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述銅酶選自由以下項(xiàng)構(gòu)成的組：裂解性多糖單加氧酶(LPMO)、漆酶、酪氨酸酶、胺氧化酶、膽紅素氧化酶、兒茶酚氧化酶、多巴胺β-單加氧酶、半乳糖氧化酶、己糖氧化酶、L-抗壞血酸氧化酶、肽基甘氨酸單加氧酶、多酚氧化酶、槲皮素2,3-雙氧化酶、以及過(guò)氧化物歧化酶。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述銅酶與所述宿主細(xì)胞是內(nèi)源的。5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述銅酶與所述宿主細(xì)胞是異源的。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)源自所述宿主細(xì)胞的啟動(dòng)子控制所述銅酶和/或所述銅金屬伴侶蛋白的表達(dá)。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞為里氏木霉(Trichodermareesei，T.reesei)細(xì)胞，并且所述啟動(dòng)子為源自里氏木霉的丙酮酸激酶(pki)或纖維二糖水解酶I(cbh1)啟動(dòng)子。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞表達(dá)至少一種另外的銅酶，其中在基本上相同的培養(yǎng)條件下，與不過(guò)表達(dá)所述銅金屬伴侶蛋白的相應(yīng)宿主細(xì)胞相比，所述至少一種另外的銅酶的產(chǎn)生水平增加。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述銅金屬伴侶蛋白為膜結(jié)合的銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述膜結(jié)合的銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶包含與SEQIDNO:6具有至少60％同一性的氨基酸序列。11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其中所述膜結(jié)合的銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶選自表2中列出的那些。12.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述銅金屬伴侶蛋白為可溶性銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述可溶性銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含與SEQIDNO:3具有至少60％同一性的氨基酸序列。14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，其中所述可溶性銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白選自表1中列出的那些。15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法，還包括在所述宿主細(xì)胞中過(guò)表達(dá)第二銅金屬伴侶蛋白。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述第一銅金屬伴侶蛋白為包含與SEQIDNO:6具有至少60％同一性的氨基酸序列的膜結(jié)合的銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶，并且所述第二銅金屬伴侶蛋白為包含與SEQIDNO:3具有至少60％同一性的氨基酸序列的可溶性銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞為絲狀真菌宿主細(xì)胞。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述絲狀真菌宿主選自由以下項(xiàng)構(gòu)成的組：曲霉屬(Aspergillus)、枝頂孢屬(Acremonium)、出芽短梗霉屬(Aureobasidium)、白僵菌屬(Beauveria)、頭孢霉屬(Cephalosporium)、擬蠟菌屬(Ceriporiopsis)、毛殼菌屬(Chaetomium)、擬青霉屬(paecilomyces)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、麥角菌屬(Claviceps)、旋孢腔菌屬(Cochiobolus)、隱球菌屬(Cryptococcus)、黑蛋巢菌屬(Cyathus)、內(nèi)座殼屬(Endothia)、Endothiamucor、鐮孢屬(Fusarium)、粘帚霉屬(Gilocladium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、Magnaporthe、毀絲霉屬(Myceliophthora)、漆斑菌屬(Myrothecium)、毛霉菌屬(Mucor)、脈孢菌屬(Neurospora)、平革菌屬(Phanerochaete)、柄孢殼菌屬(Podospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、梨孢霉屬(Pyricularia)、根毛霉屬(Rhizomucor)、根霉屬(Rhizopus)、裂褶菌屬(Schizophylum)、殼多胞菌屬(Stagonospora)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、木霉屬(Trichoderma)、嗜熱菌屬(Thermomyces)、熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、毛癬菌屬(Trichophyton)、栓菌屬(T...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：S·M·馬德里，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：丹尼斯科美國(guó)公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：美國(guó),US