用于生物合成化合物的方法、試劑和細胞技術

本文件描述了使用脂肪酸O?甲基轉移酶，硫酯酶，CoA?轉移酶和CoA連接酶中的一種或多種從前體如2?酮戊二酸生成2,3?脫氫己二酰?CoA甲酯的生物化學途徑，以及表達一種或多種此類酶的重組宿主?？梢允褂梅词?2?烯?；?CoA還原酶和甲基酯酶將2,3?脫氫己二酰CoA甲酯酶促轉化成己二酰?CoA，其繼而可以酶促轉化為己二酸，6?氨基己酸，6?羥基己酸，己內酰胺，六亞甲基二胺或1,6?己二醇。

Methods, reagents, and cells for biosynthesis of compounds

This document describes the use of O fatty acid methyltransferase, thioesterase, biochemical pathways of CoA transfer of one or more enzymes and CoA ligase in precursor such as 2 ketoglutaric acid methyl ester 2,3 has generated two acyl CoA dehydrogenation, as well as the expression of one or more of these enzymes in recombinant host. You can use the trans 2 enoyl reductase and CoA methyl esterase 2,3 dehydrogenation has two acyl methyl CoA enzymatic conversion into two acyl CoA, which in turn can be converted to adipic acid enzymatic, 6 aminocaproic acid, 6 3-hydroxyhexanoate, caprolactam, six methylene amine or two 1,6 hexandiol.

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】用于生物合成化合物的方法、試劑和細胞對相關申請的交叉引用本申請要求均于2014年6月16日提交的美國申請號62/012,674和62/012,735的權益，其公開內容通過引用全部并入本文。
本專利技術涉及使用具有脂肪酸O-甲基轉移酶活性的多肽在重組宿主中屏蔽用末端羧基基團官能化的碳鏈脂肪族主鏈的方法。本專利技術還涉及使用以下一種或多種在宿主中生物合成2,3-脫氫己二酰CoA甲酯的方法：(i)具有脂肪酸O-甲基轉移酶活性的多肽，(ii)具有硫酯酶活性或CoA轉移酶活性的多肽，或(iii)具有CoA連接酶活性的多肽，以及表達一種或多種此類外源性酶的重組宿主細胞。本專利技術還涉及使用具有反式烯?；?CoA還原酶活性的多肽和/或具有庚二酰基-[acp]甲酯酯酶活性的多肽將2,3-脫氫己二?；?CoA甲酯酶促轉化成己二酰-CoA的方法，以及表達一種或多種此類外源性酶的重組宿主細胞。此外，本專利技術還涉及將己二酰-CoA酶促轉化成己二酸，6-氨基己酸，六亞甲基二胺，己內酰胺，6-羥基己酸和1,6-己二醇(下文稱為“C6構件塊”)中的一種或多種及產生此類C6構件塊的重組宿主。專利技術背景尼龍是聚酰胺，其有時通過二胺與二羧酸的縮合聚合(condensationpolymerisation)合成。類似地，可以通過內酰胺的縮合聚合生成尼龍。一種普遍存在的尼龍是尼龍6,6，其通過六亞甲基二胺(HMD)和己二酸的反應生成。通過己內酰胺的開環聚合生成尼龍6。因此，己二酸，六亞甲基二胺和己內酰胺是生產尼龍的重要中間體(Anton&Baird,PolyamidesFibers,EncyclopediaofPolymerScienceandTechnology,2001)。在工業上，己二酸和己內酰胺通過環己烷的空氣氧化產生。環己烷的空氣氧化在一系列步驟中產生稱為KA油的環己酮(K)和環己醇(A)的混合物。KA油的硝酸氧化產生己二酸(Musser,Adipicacid,Ullmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry,2000)。己內酰胺通過其肟和隨后的酸重排由環己酮產生(Fuchs,KieczkaandMoran,Caprolactam,Ullmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry,2000)。在工業上，通過將C6構件塊氫氰化為己二腈，然后氫化成HMD來制備六亞甲基二胺(HMD)(HerzogandSmiley,Hexamethylenediamine,Ullmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry,2012)。鑒于對石油化學原料的依賴性，生物技術通過生物催化提供了備選方法。生物催化是使用生物催化劑，如酶，來進行有機化合物的生物化學轉化。生物衍生的原料和石油化學原料兩者都是用于生物催化過程的可行的起始材料。因此，針對這種背景，顯然需要生產己二酸，己內酰胺，6-氨基己酸，六亞甲基二胺和1,6-己二醇(下文稱為“C6構件塊”)的可持續方法，其中所述方法是基于生物催化劑的(Jangetal.,Biotechnology&Bioengineering,2012,109(10),2437–2459)。然而，沒有野生型原核生物或真核生物天然過度產生或排出C6構件塊到細胞外環境。然而，已經報道了己二酸和己內酰胺的代謝(Ramsayetal.,Appl.Environ.Microbiol.,1986,52(1),152–156；KulkarniandKanekar,CurrentMicrobiology,1998,37,191–194)。二羧酸己二酸通過許多細菌和酵母經由β-氧化作為碳源有效地轉化為中心代謝物。己二酸到3-氧代己二酸的β-氧化促進通過例如與芳族底物降解相關的鄰位裂解途徑的進一步分解代謝。已經全面表征了幾種細菌和真菌將3-氧代己二酰-CoA分解代謝為乙酰CoA和琥珀酰-CoA(HarwoodandParales,AnnualReviewofMicrobiology,1996,50,553–590)。己二酸和6-氨基己酸都是己內酰胺分解代謝中的中間體，最終通過3-氧代己二酰-CoA降解為中心代謝物。已經提出了從生物質-糖產生己二酸的潛在代謝途徑：(1)通過鄰位裂解芳族降解途徑從葡萄糖以生物化學方式到順式，順式粘康酸，隨后通過化學催化到己二酸；(2)通過琥珀酰-CoA和乙酰-CoA的縮合的可逆的己二酸降解途徑；和(3)組合β-氧化，脂肪酸合酶和ω-氧化。然而，沒有報道使用這些策略的信息(Jangetal.,Biotechnology&Bioengineering,2012,109(10),2437–2459)。最優性原理敘述，微生物調節它們的生物化學網絡來支持最大生物質(biomass)生長。超出在宿主生物體中表達異源途徑的需要，將碳通量引導到充當碳源的C6構件塊而非生物質生長組分與最優性原理矛盾。例如，將1-丁醇途徑從梭菌屬(Clostridium)物種轉移至其它生產菌株與天然生產者的生產性能相比經常相差一個數量級(Shenetal.,Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9),2905–2915)。6碳脂肪族主鏈作為有效前體的有效合成是在C6脂肪族主鏈上形成末端官能團，如羧基，胺或羥基基團前合成C6構件塊的關鍵考慮。專利技術概述本文件至少部分基于如下的發現，即可以通過2,3-脫氫己二酰-CoA甲酯構建生物化學途徑以產生六碳鏈脂肪族主鏈前體，其中可以形成一個或兩個官能團，即羧基，胺或羥基，從而導致己二酸，6-氨基己酸，6-羥基己酸，己內酰胺，六亞甲基二胺或1,6-己二醇(下文稱為“C6構件塊”)的合成。己二酸鹽和己二酸，6-羥基己酸鹽和6-羥基己酸，和6-氨基己酸和6-氨基己酸鹽在本文中可互換使用，是指任何其中性或離子化形式的相關化合物，包括其任何鹽形式。本領域技術人員應當理解，具體形式將取決于pH。本文所述的這些途徑，代謝工程和培養策略依賴于使用例如脂肪酸O-甲基轉移酶從2,3-脫氫己二酸生成2,3-脫氫己二酸甲酯，并且使用例如CoA連接酶從2,3-脫氫己二酸甲酯生成2,3-脫氫己二酰-CoA甲酯?？梢允褂美绶词?2-烯?；?CoA還原酶和庚二酰-[acp]甲酯酯酶從2,3-脫氫己二酰-CoA甲酯生成己二酰-CoA?？梢岳缬?i)2-酮戊二酸或琥珀酰-CoA，或(ii)從2-氧代己二酸生成2,3-脫氫己二酸，如分別在圖1和2中所示。面對最優性原理，已經令人驚訝地發現，可以組合合適的非天然途徑，原料，宿主微生物，對宿主生物化學網絡的減弱策略和培養策略，以有效地產生一個或多個C6構件塊。在一些實施方案中，可以使用硫酯酶，醛脫氫酶，7-氧代庚酸脫氫酶，6-氧代己酸脫氫酶，5-氧代戊酸脫氫酶，可逆的CoA-連接酶(例如，可逆的琥珀酰-CoA連接酶)，或CoA轉移酶(例如，戊烯二酸CoA轉移酶)酶促形成末端基團。參見圖3。在一些實施方案中，可以使用ω-轉氨酶或脫乙酰酶來酶促形成末端胺基。參見圖4、5和6。在一些實施方案中，可以使用4-羥基丁酸脫氫酶，5-羥基戊酸脫氫酶，6-羥基己酸本文檔來自技高網...

【技術保護點】
在重組宿主中屏蔽用末端羧基基團官能化的碳鏈脂肪族主鏈的方法，所述方法包括：使用具有脂肪酸O?甲基轉移酶活性的多肽在所述宿主中將n?羧基?2?烯酸酶促轉化成n?羧基?2?烯酸甲酯，其中n+1反映所述碳鏈脂肪族主鏈的長度。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.06.16 US 62/012,735;2014.06.16 US 62/012,6741.在重組宿主中屏蔽用末端羧基基團官能化的碳鏈脂肪族主鏈的方法，所述方法包括：使用具有脂肪酸O-甲基轉移酶活性的多肽在所述宿主中將n-羧基-2-烯酸酶促轉化成n-羧基-2-烯酸甲酯，其中n+1反映所述碳鏈脂肪族主鏈的長度。2.權利要求1的方法，其中所述n-羧基-2-烯酸是2,3-脫氫己二酸。3.權利要求1的方法，其中所述n-羧基-2-烯酸甲酯是2,3-脫氫己二酸甲酯，所述方法還包括將2,3-脫氫己二酸甲酯酶促轉化成己二酰CoA。4.權利要求3的方法，所述方法還包括將己二酰-CoA酶促轉化成選自下組的產物：己二酸，6-氨基己酸，6-羥基己酸，己內酰胺，己二胺和1,6己二醇。5.權利要求4的方法，其中使用一種或多種多肽將己二酰-CoA轉化為所述產物：所述多肽具有硫酯酶，可逆性CoA連接酶，戊烯二酸CoA轉移酶，ω-轉氨酶，6-羥基己酸脫氫酶，5-羥基戊酸脫氫酶，4-羥基戊酸脫氫酶，醇脫氫酶，羧酸還原酶或醇脫氫酶活性。6.在重組宿主中生成2,3-脫氫己二酰-CoA甲酯的方法，所述方法包括：使用具有脂肪酸O-甲基轉移酶活性的多肽將2,3-脫氫己二酸酶促轉化為2,3-脫氫己二酸甲酯。7.權利要求6的方法，所述方法還包括將2,3-脫氫己二酸甲酯酶促轉化成己二酰-CoA甲酯。8.權利要求6的方法，其中從2,3-脫氫己二酰-CoA酶促生成2,3-脫氫己二酸。9.權利要求8的方法，其中具有硫酯酶或CoA轉移酶活性的多肽將2,3-脫氫己二酰CoA酶促轉化為2,3-脫氫己二酸。10.權利要求9的方法，其中所述具有硫酯酶活性的多肽與SEQIDNO:4或SEQIDNO:5所示的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。11.權利要求9的方法，其中所述具有CoA轉移酶活性的多肽與SEQIDNO:24或SEQIDNO:25所示的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。12.權利要求1至11中任一項的方法，其中所述具有脂肪酸O-甲基轉移酶活性的多肽分類在EC2.1.1.15下。13.權利要求1至11中任一項所述的方法，其中所述具有脂肪酸O-甲基轉移酶活性的多肽與SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，或SEQIDNO:3所示的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。14.權利要求6的方法，其中使用EC6.2.1.-下分類的具有CoA連接酶活性的多肽將2,3-脫氫己二酸甲酯酶促轉化成2,3-脫氫己二酰-CoA甲酯。15.權利要求14的方法，其中所述具有CoA連接酶活性的多肽分類在EC6.2.1.2或EC6.2.1.3下。16.權利要求14或15的方法，所述方法還包括將2,3-脫氫己二酰-CoA甲酯酶促轉化成己二酰-CoA甲酯。17.權利要求16的方法，其中具有反式-2-烯酰基-CoA還原酶活性的多肽將2,3-脫氫己二酰-CoA甲酯酶促轉化成己二酰-CoA甲酯。18.權利要求16或權利要求17的方法，所述方法還包括將己二酰-CoA甲酯酶促轉化成己二酰-CoA。19.權利要求18的方法，其中具有庚二酰-[acp]甲酯酯酶(pimelyl-[acp]methylesteresterase)活性的多肽將己二酰-CoA甲酯酶促轉化成己二酰-CoA。20.權利要求19的方法，其中所述具有庚二酰-[acp]甲酯酯酶活性的多肽與SEQIDNO:6所示的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。21.權利要求18至20中任一項所述的方法，所述方法還包括將己二酰-CoA酶促轉化成選自下組的產物：己二酸，6-氨基己酸酯，6-羥基己酸酯，己內酰胺，六亞甲基二胺和1,6-己二醇。22.權利要求21的方法，其中所述方法包括使用具有硫酯酶，可逆的CoA-連接酶或戊烯二酸CoA轉移酶活性的多肽將己二酰CoA酶促轉化成己二酸。23.權利要求22的方法，其中所述方法還包括使用具有羧酸還原酶活性的多肽將己二酸酶促轉化成己二酸半醛。24.權利要求21的方法，其中所述方法包括使用具有乙?；┟摎涿富钚缘亩嚯膶⒓憾?CoA酶促轉化成己二酸半醛。25.權利要求23或權利要求24的方法，所述方法還包括使用具有5-氧代戊酸脫氫酶，6-氧代己酸脫氫酶，7-氧代庚酸脫氫酶或醛脫氫酶活性的多肽將己二酸半醛酶促轉化為己二酸。26.權利要求23或權利要求24的方法，所述方法還包括使用具有ω-轉氨酶活性的多肽將己二酸半醛酶促轉化為6-氨基己酸。27.權利要求23或權利要求24的方法，所述方法還包括使用具有ω-轉氨酶和/或羧酸還原酶活性的多肽將己二酸半醛酶促轉化為六亞甲基二胺。28.權利要求23或權利要求24的方法，所述方法還包括使用具有6-羥基己酸脫氫酶，5-羥基戊酸脫氫酶，4-羥基丁酸脫氫酶或醇脫氫酶活性的多肽將己二酸半醛酶促轉化為6-羥基己酸。29.權利要求28的方法，所述方法還包括使用具有羧酸還原酶和醇脫氫酶活性的多肽將6-羥基己酸酶促轉化為1,6-己二醇。30.前述權利要求中任一項的方法，其中通過發酵進行所述方法的一個或多個步驟。31.權利要求1至30中任一項的方法，其中所述宿主經受在需氧，厭氧，微需氧或混合氧/反硝化培養條件下的培養策略。32.權利要求1至31中任一項的方法，其中所述宿主在磷酸鹽，氧和/或氮限制的條件下培養。33.權利要求1至32中任一項的方法，其中使用陶瓷膜保留所述宿主以在發酵期間維持高細胞密度。34.權利要求30的方法，其中供給所述發酵的主要碳源源自生物或非生物原料。35.權利要求34的方法，其中所述生物原料是或源自單糖，二糖，木質纖維素，半纖維素，纖維素，木質素，乙酰丙酸，甲酸，甘油三酯，甘油，脂肪酸，農業廢物，濃縮酒糟(condenseddistillers’solubles)，或城市廢物。36.權利要求34的方法，其中所述非生物原料是或源自天然氣、合成氣、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸鹽、來自環己烷氧化過程的非揮發性殘留物(NVR)堿洗液(causticwash)廢物流、或對苯二甲酸/異酞酸混合物廢物流。37.權利要求29至36中任一項的方法，其中所述宿主包含一種或多種多肽，所述多肽具有減弱的聚羥基烷酸酯合酶、乙?；?CoA硫酯酶、乙?；?CoA特異性β-酮硫解酶、形成乙酸的磷酸乙酸轉移酶、乙酸激酶、乳酸脫氫酶、menaquinol-延胡索酸氧化還原酶、形成乙醇的醇脫氫酶、丙糖磷酸異構酶、丙酮酸脫羧酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、消散NADPH不平衡的轉氫酶、消散NADPH不平衡的谷氨酸脫氫酶、利用NADH/NADPH的谷氨酸脫氫酶、庚二酰-CoA脫氫酶；接受C7構件塊和中心前體作為底物的酰基-CoA脫氫酶；戊二酰-CoA脫氫酶；或己二?；?CoA合成酶活性。38.權利要求29至37中任一項的方法，其中所述宿主過表達一種或多種編碼多肽的基因，所述多肽具有乙酰基-CoA合成酶；6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶；轉酮醇酶；吡啶(puridine)核苷酸轉氫酶；甲酸脫氫酶；甘油醛-3P-脫氫酶；蘋果酸酶；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；果糖1,6二磷酸酶；L-丙氨酸脫氫酶；PEP羧化酶，丙酮酸羧化酶；PEP羧激酶；PEP合酶；對NADPH特異性的L-谷氨酸脫氫酶，用于產生輔因子不平衡；甲醇脫氫酶，甲醛脫氫酶，賴氨酸轉運蛋白；二羧酸轉運蛋白；S-腺苷甲硫氨酸合成酶；3-磷酸甘油酸脫氫酶；3-磷酸絲氨酸氨基轉移酶；磷酸絲氨酸磷酸酶；或多藥物轉運蛋白活性。39.權利要求1至38中任一項的方法，其中所述宿主是原核生物。40.權利要求39的方法，其中所述原核生物選自下組：埃希氏菌屬(Escherichia)；梭菌屬(Clostridia)；棒狀桿菌屬(C...

【專利技術屬性】
技術研發人員：AL博特斯，AVE康拉迪，
申請(專利權)人：英威達技術有限責任公司，
類型：發明
國別省市：瑞士,CH