在無氯化物和無鈉的培養基中培養橙壺菌屬的微觀藻類以產生DHA的方法技術

本發明專利技術涉及紅樹橙壺菌(Aurantiochytrium?mangrovei)類別的原生生物的培養方法。該類別在遺傳方面和通過其脂質譜來進行表征。所述方法使得能夠獲得高的生物質產率和如此培養的原生生物對于脂質(更特別地，二十二碳六烯酸(DHA))的富集。本發明專利技術涉及調制出一種培養基，其使得能夠以高細胞密度產生富含DHA的紅樹橙壺菌類別的原生生物。所述培養基是化學成分確知的，其中具有低含量的鈉離子(Na

A method for producing DHA in cultures of cultures of algae and algae without chloride or sodium

The present invention relates to mangrove orange chytridiomycetes (Aurantiochytrium mangrovei) training method category of protists. The class is genetically and characterized by its lipid mass spectrometry. The method enables the obtaining of high biomass yields and the enrichment of such protists with respect to lipids (especially, twenty-two carbon six acid (DHA)). The present invention relates to the modulation of a culture medium that enables the production of protists of the DHA rich mangrove orange mushroom class at high cell density. The culture medium is chemically known, with a low content of sodium ions (Na

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】在無氯化物和無鈉的培養基中培養橙壺菌屬的微觀藻類以產生DHA的方法本專利技術涉及紅樹橙壺菌(Aurantiochytriummangrovei)類別的破囊壺菌類細胞的培養方法.所述方法使得能夠獲得高的生物質產率和如此培養的原生生物對于脂質(更特別地，二十二碳六烯酸(DHA))的富集.本專利技術涉及制定出一種培養方法，其使得能夠在具有低含量的鈉離子(Na+)和氯離子(Cl-)的化學成分確知的培養基上以高細胞密度產生富含DHA的破囊壺菌類.本專利技術僅涉及屬于橙壺菌屬(Aurantiochytrium)的破囊壺菌類。該屬通過遺傳、代謝和生理學特征來界定.所述培養方法(通過該培養方法，在既不顯著添加鈉離子(Na+)也不顯著添加氯離子(Cl-)的情況下培養細胞)使得能夠以高細胞密度(大約125至140g/L干物質)產生紅樹橙壺菌.該生物質富含DHA，其中具有15至20g/L培養物，優選地20至25g/L培養物，或甚至25至30g/L培養物的比率.非常少量的氯化鈉，特別地非常少量的氯離子(Cl-)和鈉離子(Na+)，存在于對于該方法來說必需的培養基中.因此，在所述培養基中，存在小于1g/L，優選地小于0.5g/L，更優選地小于0.2g/L的氯離子，以及小于100mg/L，優選地小于50mg/L，和更優選地小于6mg/L的鈉離子(Na+).這使得能夠擺脫對于與培養基相接觸的設備來說必需的超額投資成本以及大幅降低處理排放物的成本，擺脫與在生物質中鈉鹽或氯化物的存在相關聯的弊端，并且通過減少投料(為了改善產率而添加到培養物中的產品)來降低培養基的成本.序言目前，原生生物是許多工業項目的目標，因為某些物種能夠積累或分泌重大量的脂質，尤其是多不飽和脂肪酸.在多不飽和脂肪酸之中，某些ω-3系列的高度不飽和的脂肪酸(HUFA)(PUFA-ω3)，特別是二十碳五烯酸(EPA或C20：5ω3)和二十二碳六烯酸(DHA或C22：6ω3)，以及某些ω-6系列的高度不飽和的脂肪酸(PUFA-ω6)，特別是花生四烯酸(ARA或AA或者二十碳四烯酸C20：4ω6)，具有公認的營養重要性并且在治療應用方面具有強大的潛力.被認為是必需營養素的DHA對于細胞的正常的和功能性的發育來說是必需的，并且在各種生物化學過程和功能中發揮關鍵作用.DHA通過摻入到細胞膜中而對于中樞神經系統的發育和視網膜的功能來說是必不可少的，并且在視覺和記憶的機制的令人滿意的獲取和維持中發揮首要作用.已知破囊壺菌類(特別是橙壺菌屬)產生DHA，當它們以異養方式進行培養時[W.K.Hong等人，(2011)，Productionoflipidscontaininghighlevelsofdocosahexaenoicacidbyanewlyisolatedmicroalga，Aurantiochytriumsp.KRS101.Appl.Biochem.Biotechnol.，164(8)：1468-80].還已知橙壺菌屬產生類胡蘿卜素，例如蝦青素、玉米黃質、角黃素、海膽酮、β-胡蘿卜素和芬尼黃質(phoenicoxanthin)[Yokoyama，R，Honda，D.(2007)TaxonomicrearrangementofthegenusSchizochytriumsensulatobasedonmorphology，chemotaxonomiccharacteristics，and18SrRNAgenephylogeny(Thraustochytriaceae，Labyrinthulomycetes)：emendationforSchizochytriumanderectionofAurantiochytriumandOblongichytriumgen.nov.；Mycoscience，Vol.48，pp.199-211].為了實施以工業規模由原生生物生產脂肪酸，應當考慮多種因素以使得該生產是贏利的.在這些因素之中，可以提及：-原料和設備(其購買或租賃及其維護)的成本，以及勞動力的成本；-生產的技術要求：例如預培養和培養步驟的數量和技術困難，培養的在線監測，和為了對產物再利用而對來自所述培養的生物質進行處理的步驟；-來自所述培養的排放物的處理.目前用于以異養方式或兼養方式培養破囊壺菌科的原生生物的培養基包含顯著量的鹽，特別是氯化鈉.作為例子，可以提及ATCCMediumNo.790這種培養基(11g/L的Na+和19g/L的Cl-).在生產油和/或其他目的分子的方法中使用氯化鈉(NaCl)來培養破囊壺菌科的海洋原生生物導致在投資和排放物處理方面的重大的超額成本，并且限制聯產物的再利用.這是因為，氯離子引起不銹鋼的壞損，所述不銹鋼是用于制造發酵罐、培養基的制備和滅菌器具以及其他用于培養微觀藻類和處理所得生物質的設備的材料.該現象的后果之一是生物質的生產和處理(“下游加工(Down-StreamProcessing)”或“DSP”)器具的過早壞損.為了避免設備壞損這一問題，可以使用由更耐氯離子的特殊合金制成的設備。這些更耐鹽的材料是成本更高的。在該情況下，用于生產的投資成本大幅升高.此外，氯化鈉(或者其他鈉鹽，例如硫酸鈉、碳酸鈉類型的鈉鹽)的使用導致在排放物處理(特別是水脫鹽)方面的重大的超額成本.最后，在由在提取油后剩余的生物質構成的油餅型聯產物中鈉鹽的存在妨礙其再利用，尤其是用于動物營養、魚類養殖，或者作為用于化妝品或在制藥工業中的成分.US5518918描述了用其他類型的鈉鹽(硫酸鈉、碳酸鈉......)來代替氯化鈉.即使這使得能夠擺脫不透鋼設備的過早損耗，但在培養基中添加鈉鹽卻既不能允許擺脫與排放物處理相關的超額成本，也不能允許擺脫上面所指出的聯產物再利用的問題.另外，用其他鈉鹽代替NaCl導致與購買替代品鹽相關的超額成本.在Yokochi等人的標題為“OptimizationofdocosahexaenoicacidproductionbySchizochytriumlimacinumSR21”的文章[(1998)Appl.Microbiol.Vol.49，pp.72-76]中，研究了蛞蝓裂殖壺菌(Schizochytriumlimacinum)SR21這一菌株對于鹽條件的耐受性.該菌株對于高的鹽濃度具有大的耐受性，所述濃度在海水濃度的50％和200％之間.該菌株在無鹽的培養物中的生長比在包含50％海水的培養物中的生長低兩倍.我們注意到，在該研究中所使用的基礎培養基還包含3％的葡萄糖和1％的酵母提取物.在專利US8,900,831中描述了聲稱“無鹽”或“低鹽濃度”的培養基.然而，如對于Yokoshi等人一樣，酵母提取物的添加對于微觀藻類的生長來說是必需的。但是，這樣的補充有酵母提取物的培養基包含超過30mg的鈉和氯的鹽.此外，酵母提取物的添加代表了關于培養基的額外成本，和還代表了在為了用作食品或藥品的最終生物質的質量方面的缺點.酵母提取物不是標準化產品，并因此酵母提取物的批次不是同質的.因此，這對于從包含酵母提取物的培養基的生物質產生的最終產品的同質性具有影響.Shabala等人[“Osmoticadjustmentandrequirementforsod本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種產生DHA的方法，該方法包括下列步驟：a)在具有小于3.5g/L的鈉離子和小于1g/L的氯離子并且具有200mM至500mM的有機含碳底物的化學成分確知的培養基中，在異養或兼養條件下，培養與序列SEQ?NO.1具有至少92％的遺傳一致性的一種或多種橙壺菌屬(Aurantiochytrium)菌株。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.04.03 FR 14529601.一種產生DHA的方法，該方法包括下列步驟：a)在具有小于3.5g/L的鈉離子和小于1g/L的氯離子并且具有200mM至500mM的有機含碳底物的化學成分確知的培養基中，在異養或兼養條件下，培養與序列SEQNO.1具有至少92％的遺傳一致性的一種或多種橙壺菌屬(Aurantiochytrium)菌株。2.根據權利要求1的培養方法，其特征在于，所述一種或多種橙壺菌屬菌株還與序列SEQNO.2具有至少96％的遺傳一致性，和/或與序列SEQNO.3具有至少91％的遺傳一致性，和/或與序列SEQNO.4具有至少95％的遺傳一致性。3.根據權利要求1或2的培養方法，其特征在于，所述培養基具有小于3.5g/L，優選地小于1g/L，更優選地小于6mg/L的鈉離子，和小于200mg/L的氯離子。4.根據權利要求1至3中任一項的方法，其特征在于，所述培養基不包含滲透壓調節劑，例如甘露糖醇、山梨糖醇、聚乙二醇和蔗糖。5.根據權利要求1至4中任一項的方法，該方法另外還包括下列步驟：b)維持所述培養物經過數代，c)回收如此培養出的生物質，d)回收所述菌株的脂質，和任選地，e)提取DHA(二十二碳六烯酸)。6.根據權利要求1至5中任一項的方法，其特征在...

【專利技術屬性】
技術研發人員：P·卡勒雅，J·帕格力爾蒂尼，O·凱格納克，F·戈達爾，
申請(專利權)人：費爾曼塔格公司，
類型：發明
國別省市：法國,FR