一種梯度因子仿生神經(jīng)修復支架制備方法技術

本發(fā)明專利技術公開了一種梯度因子仿生神經(jīng)修復支架制備方法及其應用，所述制備方法包括以下步驟：材料溶解、材料混合、凝膠去氣泡處理、梯度因子凝膠鑄模、縱向微管結構制備、冷凍干燥、梯度因子仿生神經(jīng)修復支架交聯(lián)、去除殘留交聯(lián)劑、凍干；制得梯度因子仿生神經(jīng)修復支架。本發(fā)明專利技術通過制備同時具備梯度因子及縱向仿生結構的神經(jīng)修復支架，通過化學因子誘導及物理拓撲誘導，協(xié)同促進神經(jīng)再生，解決了目前長節(jié)段神經(jīng)缺損修復材料促再生效果差，功能恢復不理想的問題。

Preparation method of gradient factor bionic nerve repairing bracket

The invention discloses a gradient factor bionic neural scaffold preparation method and application thereof. The preparation method comprises the following steps: dissolving material, material mixing, gel to bubble processing, gradient gel casting, longitudinal microtubule structure preparation, freeze drying, gradient factor bionic neural repair scaffold crosslinking, remove residual crosslinking agent freeze-dried; prepared scaffold bionic gradient factor. Through the preparation of both gradient and longitudinal bionic nerve repair scaffold, induction and physical topology induced by chemical factors synergistically promote nerve regeneration, to solve the long nerve defect repair material regeneration effect is poor, the functional recovery is not ideal problem.

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術屬于醫(yī)學
，尤其涉及一種梯度因子仿生神經(jīng)修復支架制備方法及其應用。
技術介紹
周圍神經(jīng)損傷是臨床上最嚴重的創(chuàng)傷之一。我國每年因各種原因造成的周圍神經(jīng)病例數(shù)額巨大。據(jù)統(tǒng)計，我國每年因嚴重創(chuàng)傷、先天性畸形及腫瘤切除等原因造成的周圍神經(jīng)損傷約200萬例；根據(jù)IntegraLifeScience公司估計，全球有關神經(jīng)修復的市場約為40億美元。隨著現(xiàn)代工業(yè)、交通及建筑業(yè)的發(fā)展，周圍神經(jīng)損傷的發(fā)生率呈逐年增加的趨勢，給個人、家庭及社會帶來沉重負擔。盡管周圍神經(jīng)損傷后能夠自發(fā)再生，并與靶組織重新建立突觸聯(lián)系從而恢復神經(jīng)功能，但周圍神經(jīng)損傷的臨床修復效果仍差強人意，且致殘率較高。尤其是長節(jié)段(＞3cm)神經(jīng)缺損，無法實施無張力縫合，修復更為困難，患者預后更差。長節(jié)段神經(jīng)缺損臨床治療的金標準是自體神經(jīng)移植，但供體來源有限、供區(qū)功能損害、供受神經(jīng)直徑不匹配等限制了自體神經(jīng)的應用。目前已經(jīng)商品化的神經(jīng)修復支架包括Neurotube、NeuroGen、Neuromatrix等，但均存在各種問題，如神經(jīng)導管壁易塌陷，缺乏內(nèi)部三維結構，無法引導長距離神經(jīng)缺損，更重要的是其修復效果并不理想。因此，開發(fā)一種具有更好修復效果的神經(jīng)修復產(chǎn)品具有重要的臨床意義和社會價值。在神經(jīng)發(fā)育及再生過程中，梯度神經(jīng)生長因子能夠更加有效的誘導神經(jīng)細胞生長分化。大量研究發(fā)現(xiàn)給予梯度神經(jīng)生長因子，能夠有效地誘導神經(jīng)定向生長，提高神經(jīng)再生的速度及功能恢復效果。此外，支架的拓撲結構，尤其是仿生學的設計對神經(jīng)再生也發(fā)揮的重要的引導作用。橋接支架內(nèi)部縱向排列的微管結構，能夠促進神經(jīng)細胞遷移以及軸突的延伸。因此將梯度因子復合入具有縱向排列的微管結構的神經(jīng)支架中，有望更好的促進神經(jīng)再生，取得更優(yōu)的功能恢復。目前國際上尚無將梯度因子復合入具有縱向排列的微管結構的神經(jīng)支架的報道，也無梯度因子仿生神經(jīng)修復支架制作工藝。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術的目的在于提供一種梯度因子仿生神經(jīng)修復支架制備方法及其應用，旨在解決目前商品化神經(jīng)導管均沒有誘導活性，并且缺乏內(nèi)部三維結構，無法引導長距離神經(jīng)缺損的問題。本專利技術是這樣實現(xiàn)的，一種梯度因子仿生神經(jīng)修復支架制備方法，包括以下步驟：：步驟一，材料溶解：0～250mg取殼聚糖、0～100mgI型膠原分別溶于5ml的醋酸溶液(3～6mg/ml)，4℃，溶解24小時；步驟二，材料混合：將5ml殼聚糖溶液倒入5ml膠原溶液中，用勻漿器冰水浴條件下混勻，攪拌速度2500～3000rpm，4min/次，間歇4min，重復混勻4次～5次；得到無神經(jīng)營養(yǎng)因子的混合凝膠；之后取5ml混合凝膠，加入2500ngNGF或GDNF促神經(jīng)再生的神經(jīng)營養(yǎng)因子，形成500ng/ml濃度的混合有神經(jīng)營養(yǎng)因子的凝膠；步驟三，凝膠去氣泡處理：先用真空泵抽真空5min，放氣使氣泡破碎，重復4～5次；之后離心機5000rpm離心3～5min；再次真空泵抽真空5min，放氣使氣泡破碎，重復4～5次；最后離心機5000rpm離心3～5min；步驟四，梯度因子凝膠鑄模：將混合有神經(jīng)營養(yǎng)因子的凝膠及無神經(jīng)營養(yǎng)因子的混合凝膠分別裝入1ml注射器，并分別安裝兩個可編程微量注射泵，兩注射器通過Y型管連接到一個混勻器。將混合有神經(jīng)營養(yǎng)因子的凝膠和無神經(jīng)營養(yǎng)因子的凝膠通過變速控制，注入混勻器中，之后注入圓柱形模具，并在圓柱形模具一端塞入與圓柱形模具內(nèi)經(jīng)相匹配的銅塞；最終在圓柱形模具中形成一個沿縱向的因子梯度；步驟五，縱向微管結構制備：圓柱形模具裝入垂直下落架，銅塞距離外部的液氮面5cm～10cm，下落架連接于勻速下降儀上，以1mm/min～5mm/min速度下降；待全部浸入液氮后，取出圓柱形模具；步驟六，冷凍干燥：去除圓柱形模具的銅塞；預冷冷凍干燥機30min～60min；冷凍干燥18h～24h，至圓柱形模具完全干燥；步驟七，梯度因子仿生神經(jīng)修復支架交聯(lián)：將制好支架從圓柱形模具中取出，放入20ml0.5％～10％京尼平乙醇溶液4℃交聯(lián)4小時～48小時，或放入NHS/EDC溶液交聯(lián)24h～48h；步驟八，去除殘留交聯(lián)劑：將交聯(lián)支架從交聯(lián)劑中取出，放入200mlpH7.0-7.5的蒸餾水中，搖床40rpm，1小時/次，重復洗3次～6次；；步驟九，凍干：將清洗的神經(jīng)支架取出，放入-80℃冷凍30分鐘～60分鐘，放入預冷凍干機中凍干18小時～24小時；制得梯度因子仿生神經(jīng)修復支架。進一步，步驟四中，將混合有神經(jīng)營養(yǎng)因子的凝膠及無神經(jīng)營養(yǎng)因子的混合凝膠分別裝入1ml注射器，并分別安裝兩個可編程微量注射泵，所述兩個可編程微量注射泵通過變速注射控制，裝有含神經(jīng)營養(yǎng)因子凝膠無神經(jīng)營養(yǎng)因子凝膠的注射器一加速，裝有混合含神經(jīng)營養(yǎng)因子凝膠的注射器二減速，兩個注射器的流速之和恒定不變。進一步，梯度因子仿生神經(jīng)修復支架內(nèi)徑為1mm～8mm；長度為1cm～10cm或者大于10cm。進一步，神經(jīng)營養(yǎng)因子為NGF、GDNF、BDNF、NT3、VEGF、CNTF中的一種。進一步，最終在模具中形成一個沿縱向的因子梯度，因子梯度為線性濃度梯度。進一步，步驟一中，優(yōu)選250mg殼聚糖、100mgI型膠原分別溶于5ml醋酸溶液中得到的混合凝膠；或為單純明膠溶于5ml醋酸溶液中得到的混合凝膠，單純明膠占無神經(jīng)營養(yǎng)因子的混合凝膠的質(zhì)量比為1％～5％；步驟七中，交聯(lián)劑優(yōu)選1％京尼平乙醇溶液，交聯(lián)24小時。進一步，所述裝有含神經(jīng)營養(yǎng)因子凝膠無神經(jīng)營養(yǎng)因子凝膠的注射器一加速，裝有混合含神經(jīng)營養(yǎng)因子凝膠的注射器二減速，兩個注射器的流速之和恒定不變；具體包括：裝有無神經(jīng)營養(yǎng)因子混合凝膠的注射器一通過可編程微量注射泵一控制，凝膠流速由0μl/min逐漸加速，3min達60μl/min，之后以60μl/min恒定流速，裝有無神經(jīng)營養(yǎng)因子凝膠的注射器一再注射1min，使60μl不含因子的凝膠體積剛好為Y型管處到圓柱形模具之間通道殘留的凝膠體積裝有混合含神經(jīng)營養(yǎng)因子凝膠的注射器二通過可編程微量注射泵二控制，流速由60μl/min逐漸減速，3min末達0μl/min；含神經(jīng)營養(yǎng)因子凝膠無神經(jīng)營養(yǎng)因子凝膠。本專利技術另一目的在于提供一種利用上述制備方法制備的梯度因子仿生神經(jīng)修復支架的促進神經(jīng)再生方法，該梯度因子仿生神經(jīng)修復支架的促進神經(jīng)再生方法包括：促神經(jīng)再生的營養(yǎng)因子沿神經(jīng)支架縱向形成由低濃度到高濃度的因子梯度，通過化學誘導方向性神經(jīng)再生；同時神經(jīng)支架利用縱向平行排列的微管結構，通過物理引導神經(jīng)再生。本專利技術通過制備同時具備梯度因子及縱向仿生結構的神經(jīng)修復支架，通過化學因子誘導及物理引導，協(xié)同促進神經(jīng)再生，解決了目前長節(jié)段神經(jīng)缺損修復材料促再生效果差，功能恢復不理想的問題。附圖說明圖1是本專利技術實施例提供的梯度因子仿生神經(jīng)修復支架制備方法流程圖；圖2是本專利技術實施例提供的梯度因子制作系統(tǒng)示意圖；圖3是本專利技術實施例提供的圓柱形模具圖；圖中：1、注射器一、2、注射器二；3、可編程微量注射泵一；4、可編程微量注射泵二；5、Y型管；6、螺旋混勻器；7、銅塞；8、聚四氟乙烯厚壁圓柱管。圖4是本專利技術實施例提供的兩可編程注射泵通過控制流速，在內(nèi)徑為2mm，長度為6cm的圓柱形模具內(nèi)形成線性因子梯度圖。圖5是本專利技術實施例提供的梯度因子仿生支架掃本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種梯度因子仿生神經(jīng)修復支架制備方法，其特征在于，所述梯度因子仿生神經(jīng)修復支架制備方法包括以下步驟：步驟一，材料溶解：0～250mg取殼聚糖、0～100mg?I型膠原分別溶于5ml的醋酸溶液，4℃，溶解24小時；步驟二，材料混合：將5ml殼聚糖溶液倒入5ml膠原溶液中，用勻漿器冰水浴條件下混勻，攪拌速度2500～3000rpm，4min/次，間歇4min，重復混勻4次～5次；得到無神經(jīng)營養(yǎng)因子的混合凝膠；之后取5ml混合凝膠，加入2500ng?NGF或GDNF促神經(jīng)再生的神經(jīng)營養(yǎng)因子，形成500ng/ml濃度的混合有神經(jīng)營養(yǎng)因子的凝膠；步驟三，凝膠去氣泡處理：先用真空泵抽真空5min，放氣使氣泡破碎，重復4～5次；之后離心機5000rpm離心3～5min；再次真空泵抽真空5min，放氣使氣泡破碎，重復4～5次；最后離心機5000rpm離心3～5min；步驟四，梯度因子凝膠鑄模：將混合有神經(jīng)營養(yǎng)因子的凝膠及無神經(jīng)營養(yǎng)因子的混合凝膠分別裝入1ml注射器，并分別安裝兩個可編程微量注射泵，兩注射器通過Y型管連接到一個混勻器；將混合有神經(jīng)營養(yǎng)因子的凝膠和無神經(jīng)營養(yǎng)因子的凝膠通過變速控制，注入混勻器中，之后注入圓柱形模具，并在圓柱形模具一端塞入與圓柱形模具內(nèi)經(jīng)相匹配的銅塞；最終在圓柱形模具中形成一個沿縱向的因子梯度；步驟五，縱向微管結構制備：圓柱形模具裝入垂直下落架，銅塞距離外部的液氮面5cm～10cm，下落架連接于勻速下降儀上，以1mm/min～5mm/min速度下降；待全部浸入液氮后，取出圓柱形模具；步驟六，冷凍干燥：去除圓柱形模具的銅塞；預冷冷凍干燥機30min～60min；冷凍干燥18h～24h，至圓柱形模具完全干燥；步驟七，梯度因子仿生神經(jīng)修復支架交聯(lián)：將制好支架從圓柱形模具中取出，放入20ml?0.5％～10％京尼平乙醇溶液4℃交聯(lián)4小時～48小時，或放入NHS/EDC溶液交聯(lián)24h～48h；步驟八，去除殘留交聯(lián)劑：將交聯(lián)支架從交聯(lián)劑中取出，放入200ml?pH7.0?7.5的蒸餾水中，搖床40rpm，1小時/次，重復洗3次～6次；步驟九，凍干：將清洗的神經(jīng)支架取出，放入?80℃冷凍30分鐘～60分鐘，放入預冷凍干機中凍干18小時～24小時；制得梯度因子仿生神經(jīng)修復支架。...

【技術特征摘要】
1.一種梯度因子仿生神經(jīng)修復支架制備方法，其特征在于，所述梯度因子仿生神經(jīng)修復支架制備方法包括以下步驟：步驟一，材料溶解：0～250mg取殼聚糖、0～100mgI型膠原分別溶于5ml的醋酸溶液，4℃，溶解24小時；步驟二，材料混合：將5ml殼聚糖溶液倒入5ml膠原溶液中，用勻漿器冰水浴條件下混勻，攪拌速度2500～3000rpm，4min/次，間歇4min，重復混勻4次～5次；得到無神經(jīng)營養(yǎng)因子的混合凝膠；之后取5ml混合凝膠，加入2500ngNGF或GDNF促神經(jīng)再生的神經(jīng)營養(yǎng)因子，形成500ng/ml濃度的混合有神經(jīng)營養(yǎng)因子的凝膠；步驟三，凝膠去氣泡處理：先用真空泵抽真空5min，放氣使氣泡破碎，重復4～5次；之后離心機5000rpm離心3～5min；再次真空泵抽真空5min，放氣使氣泡破碎，重復4～5次；最后離心機5000rpm離心3～5min；步驟四，梯度因子凝膠鑄模：將混合有神經(jīng)營養(yǎng)因子的凝膠及無神經(jīng)營養(yǎng)因子的混合凝膠分別裝入1ml注射器，并分別安裝兩個可編程微量注射泵，兩注射器通過Y型管連接到一個混勻器；將混合有神經(jīng)營養(yǎng)因子的凝膠和無神經(jīng)營養(yǎng)因子的凝膠通過變速控制，注入混勻器中，之后注入圓柱形模具，并在圓柱形模具一端塞入與圓柱形模具內(nèi)經(jīng)相匹配的銅塞；最終在圓柱形模具中形成一個沿縱向的因子梯度；步驟五，縱向微管結構制備：圓柱形模具裝入垂直下落架，銅塞距離外部的液氮面5cm～10cm，下落架連接于勻速下降儀上，以1mm/min～5mm/min速度下降；待全部浸入液氮后，取出圓柱形模具；步驟六，冷凍干燥：去除圓柱形模具的銅塞；預冷冷凍干燥機30min～60min；冷凍干燥18h～24h，至圓柱形模具完全干燥；步驟七，梯度因子仿生神經(jīng)修復支架交聯(lián)：將制好支架從圓柱形模具中取出，放入20ml0.5％～10％京尼平乙醇溶液4℃交聯(lián)4小時～48小時，或放入NHS/EDC溶液交聯(lián)24h～48h；步驟八，去除殘留交聯(lián)劑：將交聯(lián)支架從交聯(lián)劑中取出，放入200mlpH7.0-7.5的蒸餾水中，搖床40rpm，1小時/次，重復洗3次～6次；步驟九，凍干：將清洗的神經(jīng)支架取出，放入-80℃冷凍30分鐘～60分鐘，放入預冷凍干機中凍干18小時～24小時；制得梯度因子仿生神經(jīng)修復支架。2.如權利要求1所述的梯度因子仿生神經(jīng)修復支架制備方法，其特征在于，步驟四中...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：黃亮亮，黃景輝，羅卓荊，
申請(專利權)人：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學，
類型：發(fā)明
國別省市：陜西;61