本發明專利技術公開了一種用于擴增鳥類IFNA基因CDS序列的引物及其方法，所述引物包括序列號為SEQ?ID?NO.1的DNIFNA?F和序列號為SEQ?ID?NO.2的DNIFNA?R。所述方法包括：(1)提取待測樣品的總基因組DNA；(2)采用所述引物對步驟(1)中提取的總基因組DNA進行PCR擴增；(3)對步驟(2)擴增后的產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。本發明專利技術通過設計一對特異性PCR引物，對待測樣品通過一次PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測是否有條帶，從顯示判定擴增效果，且所用的模板可從動物肌肉組織中提取，大大降低了取樣的難度。
Primer for amplifying avian IFNA gene CDS sequence and method thereof
The invention discloses a primer for amplification of the avian IFNA CDS sequences and its method, the primers include sequence number SEQ ID NO.1 DNIFNA F and the serial number is SEQ ID NO.2 DNIFNA R. The method comprises the following steps: (1) the total genomic DNA was extracted from the sample; (2) using the primers of step (1) extraction of total genomic DNA was amplified by PCR; (3) to step (2) amplified products were detected by agarose gel electrophoresis. The present invention by designing a pair of specific PCR primers to the sample through a PCR amplification by agarose gel electrophoresis to detect whether there is a band from the display to determine the amplification effect, and the template can be extracted from animal muscle tissue, greatly reduces the difficulty of sampling.
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物檢測
，具體涉及一種用于擴增鳥類IFNA基因CDS序列的引物及其方法。
技術介紹
IFNA基因(interferonalpha)CDS干擾素-α。干擾素(interferon，IFN)是一類在特定誘導劑(細菌、病毒等)作用下產生的一類具有抗病毒[1]、抗腫瘤[2]、免疫調節[3]等生物學功能的細胞因子，是由Isaacs等在利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感病毒的干擾現象時發現。根據氨基酸的序列、干擾素的功能及相應受體的結合，可將干擾素分為3種類型：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。Ⅰ型干擾素包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-ε、IFN-τ、IFN-δ、IFN-κ、IFN-ξ。Ⅱ型干擾素包括IFN-γ，Ⅲ型干擾素包括IL-28A、IL-28B、IL29。干擾素-α是由脊椎動物細胞受到病毒侵染時，由白細胞產生的一種調節蛋白，主要作用是抗病毒。在人和小鼠中，IFNA基因分別位于9號染色體的短臂和4號染色體的著絲粒近端區域。在原雞中，IFNA位于Z染色體上。目前，NCBI上已釋放鳥類IFNA序列較少，而諸多鳥類基因組注釋尚不完整，從基因組中獲取IFNA基因序列有限，所以亟需豐富鳥類IFNA基因的序列信息，以為研究鳥類干擾素抗病毒機制研究提供理論基礎。雁形目鳥類屬于水禽，我國是水禽養殖大國，近年來受禽流感疫情等影響，各種禽類疾病成為阻礙水禽發展的重要因素。鑒于干擾素-α廣譜的抗病毒作用，因此對雁形目鳥類IFNA抗病毒機制和應用的研究迫在眉睫。而目前關于雁形目鳥類IFNA，特別是CDS區的分子數據較少。
技術實現思路
根據以上現有技術的不足，本專利技術所要解決的技術問題是提出一種用于擴增鳥類IFNA基因CDS序列的引物及其方法，目的是快速、準確的獲取鳥類的IFNA基因CDS序列。為了解決上述技術問題，本專利技術采用的技術方案為：一種用于擴增鳥類IFNA基因CDS序列的引物，所述引物包括序列號為SEQIDNO.1的DNIFNA-F和序列號為SEQIDNO.2的DNIFNA-R。優選的，所述鳥類為雁形目鳥類。一種利用所述引物擴增鳥類IFNA基因CDS序列的方法，包括如下步驟：(1)提取待測樣品的總基因組DNA；(2)采用所述引物對步驟(1)中提取的總基因組DNA進行PCR擴增；(3)對步驟(2)擴增后的產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR擴增采用12.5uL體系:ddH2O6.985uL，10×Ex-taqbuffer1.25uL，dNTPs(2.5mmol/L)1uL，Template1uL，DNIFNA-F(5umol/L)1.1uL，DNIFNA-R(5umol/L)1.1uL，Ex-taq(5U/uL)0.065uL。PCR反應體系為：95℃預變性5min。然后進行36個循環，該循環包括94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min。最后72℃延伸10min。通過對雁形目四個屬七種鳥類采用本專利技術的方法實驗，通過瓊脂糖凝膠電泳圖可以看出，對應PCR產物泳道均有條帶。在本專利技術中，出現的7條條帶中，所含有的DNA片段的長度大致相等，在750bp-1000bp之間。為了達到更好的PCR擴增效果，使得得到的瓊脂糖凝膠電泳圖更清晰可見，同時節約成本，以12.5ul的PCR擴增體系為基準，每條引物的濃度分別為1.1ul，DNA模板的用量為1ul。其中，用于PCR擴增的聚合酶以及緩沖液可以為本領域常規聚合酶和緩沖液，其用量具體的可以參照產品說明書中的詳細說明。本專利技術在此不再詳細贅述。所述PCR擴增過程中的退火過程可以為本領域所常規使用的退火方式及退火參數，在本專利技術中，為了得到更好的擴增效果，所述PCR擴增過程的退火溫度為55℃，退火時間為30s。另外，對于PCR擴增中的變性條件、延伸條件以及循環數等參數的設置均為本領域常規的設置，本專利技術在此不再詳細贅述。本專利技術有益效果是:本專利技術通過設計一對特異性PCR引物，對待測樣品通過一次PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測是否有條帶，從顯示判定擴增效果，且所用的模板可從動物肌肉組織中提取，大大降低了取樣的難度，而且該方法可簡便快速獲取雁形目七種鳥類IFNA基因序列，從而達到簡便易行，經濟實用的目的。為深入研究雁形目鳥類干擾素抗病毒機制研究提供理論基礎。附圖說明下面對本說明書附圖所表達的內容及圖中的標記作簡要說明：圖1是本專利技術雁形目七種鳥類PCR擴增后瓊脂凝膠電泳圖。其中，泳道1來自斑嘴鴨肌肉樣品、泳道2來自白額雁的肌肉樣品、泳道3來自翹鼻麻鴨的肌肉樣品、泳道4來自鴻雁的肌肉樣品、泳道5來自赤麻鴨的肌肉樣品、泳道6來自大天鵝的肌肉樣品、泳道7來自豆雁的肌肉樣品，泳道0為分子量標記。具體實施方式下面通過對實施例的描述，對本專利技術作進一步詳細的說明，以幫助本領域技術人員對本專利技術的專利技術構思、技術方案有更完整、準確和深入的理解。需要闡明的是，所述引物均由通用生物系統(安徽)有限公司合成且引物濃度為5umol，本專利技術中使用的dNTPMix為Takara公司的市售品，其余所使用的化學試劑均為常規市售分析純試劑。樣品取材：雁形目四個屬七種鳥類：1只斑嘴鴨(鴨屬)，1只赤麻鴨(麻鴨屬)，1只翹鼻麻鴨(麻鴨屬)，1只大天鵝(天鵝屬)，1只鴻雁(雁屬)、1只豆雁(雁屬)、1只白額雁(雁屬)。實施例11)總基因組的提取：采用酚-氯仿抽提法，取約100mg肌肉組織樣本，剪碎后置于一只已滅菌的2.0ml的EP管；2)在EP管中加入1ml的DNA提取液及4ul20mg/ml的RNaseA(核糖核酸酶)，搖勻后置于37℃水浴鍋中水浴1h；3)取出EP管，加入5ul20mg/ml的蛋白酶K，搖勻后置于37℃水浴鍋中水浴約2-3h，直至肌肉完全消化，期間每隔10min上下搖勻；4)取出EP管，待冷卻至室溫后，加入等體積的飽和酚，溫和上下搖勻約7分鐘直至水相與酚相混合成乳狀液；5)10000rPm，10℃下離心15min，取出上層水相至另一20mlEP管中；6)重復酚提取一二次；7)加入等體積的CI(氯仿異戊醇)，溫和上下搖勻約7min，10000rPm，10℃下離心15min，取出上層水相至另一2.0mlEP管中；8)再次加入等體積的CI和上下搖勻約7min，10000rPm，10℃下離心15min，取出上層水相至另一1.5mlEP管中(分裝到2管中，每管300ul)9)加入1/5體積的3mol/lNaAC及2倍體積預冷的無水乙醇，室溫輕搖EP管置于-20℃冰柜中冷凍3h；10)從冰柜中取出EP管，12000rPm，4℃離心15min，并棄上清；11)加入500ul75％乙醇漂洗，12000rPm，4℃離心15min，并棄上清；12)再加入500ul75％乙醇漂洗，12000rPm，4℃離心15min，并棄上清，后風干沉淀；13)加入100ul1×TE溶解DNA；14)取2ulDNA溶液進行瓊脂糖凝膠電泳；15)總DNA置于-40℃冰柜中儲存。以七種雁形目鳥類的總DNA為模板，進行PCR擴增。PCR擴增采用12.5uL體系:ddH2O6.985uL，10×Ex-taqbuffer1.25uL，dNTPs(2.5mmol/L)1uL，Template1uL，DNIFNA-F(5umol/L)本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種用于擴增鳥類IFNA基因CDS序列的引物，其特征在于，所述引物包括序列號為SEQ?ID?NO.1的DNIFNA?F和序列號為SEQ?ID?NO.2的DNIFNA?R。
【技術特征摘要】
1.一種用于擴增鳥類IFNA基因CDS序列的引物，其特征在于，所述引物包括序列號為SEQIDNO.1的DNIFNA-F和序列號為SEQIDNO.2的DNIFNA-R。2.根據權利要求1所述用于擴增鳥類IFNA基因CDS序列的引物，其特征在于，所述鳥類為雁形目鳥類。3.采用權利要求1或2所述引物在鳥類IFNA基因CDS序列測序中的應用。4.一種利用權利要求1或2所述引物擴增鳥類IFNA基因CDS序列的方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)提取待測樣品的總基因組DNA；(2)采用...
【專利技術屬性】
技術研發人員：闞顯照，章勤，丁恒武，王瑩，王青青，蔣瀾，吳璇，易雙龍，陳仁瑞，宛鳳英，王會梅，
申請(專利權)人：安徽師范大學，
類型：發明
國別省市：安徽;34
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