桉樹成分實時熒光PCR檢測方法及其試劑盒技術

本發明專利技術涉及桉樹成分實時熒光PCR檢測方法及其試劑盒。本發明專利技術揭示了一種可特異性鑒定桉樹成分的引物，所述引物針對含有桉樹成分的DNA可發生特異性擴增，而對沒有桉樹成分的DNA不發生特異性擴增。本發明專利技術還提供了一種簡化的PCR檢測方法，所述的方法可良好地應用于鑒定桉樹成分，并且具有良好的再現性、靈敏度。

【技術實現步驟摘要】
桉樹成分實時熒光PCR檢測方法及其試劑盒
本專利技術屬于PCR檢測領域，更具體地，本專利技術涉及桉樹成分實時熒光PCR檢測方法及其試劑盒。
技術介紹
蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經充分釀造而成的天然甜物質。每年全世界的蜂蜜總產量大概有130萬噸，產量分布情況如下：歐洲占23％，北美洲占16％，南美洲占10％，亞洲占37％，還有大洋洲占2％。而中國是世界上最大的蜂蜜生產和出口國，每年蜂蜜總產量在30～40萬噸之間，總年產值也在80億人民幣左右。2013年中國蜂產品協會統計數據顯示，中國近年來蜂蜜年出口保持在10萬噸左右，2012年出口達到了11萬噸，占世界蜂蜜貿易總量的1/4，出口量世界第一。由于蜂蜜市場需求旺盛，產量難以滿足國內外市場需要，為了獲得更高的市場份額，在經濟利益的驅動下，部分蜂蜜生產企業利用蜂蜜市場監管不足、檢測技術薄弱、消費者難以識別等弱點，大量生產制造假蜂蜜，投入市場，牟取暴利。據統計，摻假占據了蜂蜜市場的20％～30％。蜂蜜摻假的方式主要有兩種，一種是以假亂真，即加入其它價格低廉的甜味物質，例如糖和工業糖漿，來提高蜂蜜的產量。有些不法廠家為了改善摻假蜂蜜的外觀品質，甚至還摻入焦糖色素、合成色素等。蜂蜜香精的出現更使得假蜂蜜幾乎可以亂真。另一種摻假方法就是以次充好，包括用價格低廉的雜花蜜充當價格相對較高的單一花種蜂蜜，用價格相對低廉的單花種蜂蜜摻入高價單花種蜂蜜。從某種意義上雖然沒有摻入外源的糖分造成蜂產品偽劣，但在一定程度上也存在假冒問題，消費者權益受到侵害。此外，歐美國家對于蜂蜜進口質量要求比國內嚴格，檢測指標較多，由于我國蜂蜜質量情況良莠不齊，蜂蜜出口貿易受到極大限制。且蜂蜜摻假行為嚴重損害了消費者利益，損壞了我國天然蜂蜜的產品信譽，阻礙了中國蜂業的健康發展。隨著蜂蜜摻假的水平的不斷提高，蜂蜜的真偽評價難度加大。傳統的檢測方法已經不能滿足生產實踐和應用中的需求?，F代分析技術在蜂蜜摻假識別雖具有很大優勢及發展空間，但價格昂貴，且由于不同蜂蜜品種自身的復雜性，千差萬別的來源產地，以及受采收季節、儲存、加工等因素影響，使得檢測帶有很大的不確定性，而且不能有效區分混合蜂蜜和單一蜜，及低價蜜摻雜高價蜜。且目前更多的技術處在實驗室研究階段，實用性不高、不能全方面的推廣。因此，亟需建立快速、準確、易推廣的蜂蜜身份鑒定方法，用于對蜂蜜的真偽及種類進行準確區分，以完善現有的管理體系。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供桉樹成分實時熒光PCR檢測方法及其試劑盒。在本專利技術的第一方面，提供一種鑒定桉樹成分的方法，所述方法包括：以待測樣品的DNA為模板，以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物進行PCR擴增；若發生特異性擴增，則表明待測樣品中包含桉樹成分。在一個優選例中，以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物以及SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的Taqman探針進行實時熒光PCR檢測。在另一優選例中，以ndhB基因作為檢測內參，檢測ndhB基因的引物如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。在另一優選例中，以SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的引物以及SEQIDNO:7所述的Taqman探針進行ndhB基因的實時熒光PCR檢測。在另一優選例中，所述的待測樣品是食品、飲料、植物、植物制品(如植物精油等)。在本專利技術的另一方面，提供一種用于鑒定桉樹成分的引物，所述引物是引物對，其序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。在本專利技術的另一方面，提供一種用于鑒定桉樹成分的Taqman探針，所述的探針序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。在本專利技術的另一方面，提供所述的引物和所述的Taqman探針的用途，用于從待測樣品中鑒定桉樹成分。在本專利技術的另一方面，提供一種鑒定桉樹成分的試劑盒，其中包括前面所述的引物和前面所述的Taqman探針。在一個優選例中，所述試劑盒中還包括：檢測ndhB基因的引物，其序列如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。在另一優選例中，所述試劑盒中還包括選自以下的試劑：DNA提取試劑，Taq酶，PCR緩沖液，DNA聚合酶，和/或說明鑒定桉樹成分的方法的使用說明書。本專利技術的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。附圖說明圖1、內參照實時熒光PCR通用性檢測。其中，48種顯花植物樣品DNA顯示特異性的擴增曲線，陰性對照及空白對照無特異性的擴增曲線。圖2、桉樹引物探針實時熒光PCR。其中，7個桉樹品種樣品DNA顯示特異性的擴增曲線，其它DNA樣品及空白對照無特異性擴增曲線。圖3、檸檬桉引物探針實時熒光PCR擴增反應及其標準曲線。其中，上述為擴增曲線，下圖為標準曲線。圖4、直干桉引物探針實時熒光PCR擴增反應及其標準曲線。其中，上述為擴增曲線，下圖為標準曲線。圖5、藍桉引物探針實時熒光PCR擴增反應及其標準曲線。其中，上述為擴增曲線，下圖為標準曲線。圖6、檸檬桉成分最低檢測限檢測結果。其中，基線上方為1％桉樹蜜/油菜蜜DNA的擴增曲線，陰性對照及空白對照無特異性的擴增曲線。圖7、藍桉成分最低檢測限檢測結果。其中，基線上方為1％桉樹蜜/油菜蜜DNA的擴增曲線，陰性對照及空白對照無特異性的擴增曲線。圖8、市售蜂蜜中桉樹成分檢測結果。其中，圖中標號表示各市售樣品的編號，1為荔枝和荊條混合蜜，2為荊條蜜，3為油菜和向日葵混合蜜，4為洋槐和龍眼混合蜜，5為紫云英和向日葵混合蜜，6為洋槐蜜，7為桉樹蜜，8為桉樹蜜。具體實施方式本專利技術人經過廣泛而深入的研究和試驗，首次揭示一種可特異性鑒定桉樹成分的引物，所述引物針對含有桉樹成分的DNA可發生特異性擴增(獲得陽性結果)，而對沒有桉樹成分的DNA不發生特異性擴增(獲得陰性結果)。為了簡化PCR擴增方法，本專利技術人還設計了配合所述引物的、用于進行實時熒光PCR的Taqman探針。采用所述的引物配合Taqman探針，可良好地應用于鑒定桉樹成分，并且具有良好的再現性、靈敏度。如本文所用，所述的“桉樹成分”是指特異性來自于桉樹的成分，可以是桉樹本身或其加工產品，包括蜂蜜等。桉樹(EucalyptusrobustaSmith)又稱尤加利樹，是桃金娘科桉屬植物的統稱。桉樹蜜的蜜源主要是大葉桉、小葉桉、和檸檬桉等。桉樹蜜有養胃補虛、清熱、補中、解毒、潤燥的功效，還有一定的鎮定作用，營養價值較高。鑒于目前蜂蜜魚龍混雜的狀況，需要以有效的手段來區分真正來自于桉樹作為蜜源的蜂蜜。引物和探針本專利技術人通過桉樹及其它物種在基因層面的比較和篩選，獲得一種可特異性鑒定桉樹成分的引物，其對于桉樹的DNA發生特異性擴增，而對沒有桉樹成分的DNA不發生特異性擴增。因此，本專利技術提供一種引物，所述的引物具SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。本專利技術的這些引物還可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學發光物質進行標記。本專利技術還提供一種探針，所述的探針是具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列和具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列的兩條探針；較佳地，所述的探針是Taqman探針，從而便于實時熒光檢測。檢測內參本專利技術人經過反復篩選，還獲得了一組適用于作為內參的本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種鑒定桉樹成分的方法，其特征在于，所述方法包括：以待測樣品的DNA為模板，以SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示的引物進行PCR擴增；若發生特異性擴增，則表明待測樣品中包含桉樹成分。

【技術特征摘要】
1.一種鑒定桉樹成分的方法，其特征在于，所述方法包括：以待測樣品的DNA為模板，以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物進行PCR擴增；若發生特異性擴增，則表明待測樣品中包含桉樹成分。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物以及SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的Taqman探針進行實時熒光PCR檢測。3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，以ndhB基因作為檢測內參，檢測ndhB基因的引物如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，以SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的引物以及SEQIDNO:7所述的Taqman探針進行ndhB基因的實時熒光PCR檢測。5.如權利要求1所述的方法，其...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李想，李輝，高琴，劉博，任怡菲，門光琦，
申請(專利權)人：中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局，上海輝睿生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：上海,31