本發明專利技術屬于基因工程領域，具體為針對c?Myc標簽的單域重鏈抗體，其具有SEQ?ID?NO.:1所示的氨基酸序列，可用于免疫檢測、抗原富集純化等領域。本發明專利技術所提供的氨基酸序列可以作為前體，通過隨機或定點突變技術進行改造，能夠獲得性質(親和性、特異性、穩定性等)更好的突變體，用來發展進一步用于醫藥、工業、農業的蛋白質或多肽。
【技術實現步驟摘要】
一種能特異性結合c-Myc標簽的納米抗體
本專利技術涉及單域重鏈抗體技術(又稱納米抗體技術)，以及基因工程抗體技術，特別是針對c-Myc標簽的單域重鏈抗體或多肽。技術背景c-Myc標簽蛋白的發現源于1985年Evan制備獲得了一株針對人原癌基因產物Myc蛋白的單克隆抗體9E10，此后研究發現該抗體識別的表位由10個氨基酸殘基組成，其序列為Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，并且這10個氨基酸與其它蛋白融合表達后依然能夠保持很強的抗原活性，可以被相應抗體識別，而且不受到蛋白框架的影響。因此，c-Myc標簽系統廣泛應用于免疫學檢測、細胞成像、親和純化以及蛋白質工程等領域。本專利技術公開了一種可以與c-Myc標簽特異性結合的單域重鏈抗體(即納米抗體，下同)，可用于c-Myc標簽融合蛋白的檢測及純化。目前市場上已經有針對c-Myc標簽的單克隆或多克隆抗體用于檢測，但單克隆抗體的研發和生產過程及其繁瑣和復雜，多克隆抗體來源有限。相比之下，單域重鏈抗體僅由一個結構域組成，具有耐酸堿、耐高溫、特異性高、分子量小和可大規模生產等優點，用單域重鏈抗體作為配基制備的純化介質具有成本低、可重復使用等優點，應用前景廣闊。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供針對c-Myc標簽的單域重鏈抗體，可以被用于制備檢測和純化c-Myc標簽的試劑和工具。本專利技術提供一個針對c-Myc標簽的單域重鏈抗體(即本專利技術一種能特異性結合c-Myc標簽的納米抗體，下同)，具有SEQIDNO.:1所示的氨基酸序列。其氨基酸序列的IMGT編號和結構域的劃分包括四個框架區(Frameworkregion,FR)和三個互補決定區(Complementarity-determiningregion,CDR)。本專利技術提供一個核酸分子，其特征是編碼SEQIDNO.:1，通過遺傳密碼子可以隨時獲得該核酸分子的具體序列。本專利技術還提供一個核酸分子，其特征是編碼SEQIDNO.:1部分結構域，通過遺傳密碼子可以隨時獲得該核酸分子的具體序列。可以為SEQIDNO.:2核酸分子。本專利技術所提供的核苷酸序列或者至少部分序列可以通過合適的表達系統進行表達以得到相應的蛋白質或多肽。這些表達系統包括細菌，酵母菌，絲狀真菌，動物細胞，昆蟲細胞，植物細胞，或無細胞表達系統。本專利技術還提供一種載體，包含所述核酸序列。由于遺傳密碼子具有簡并性，該核酸序列可以根據不同的應用目的而不同。本專利技術還提供一種宿主細胞，包括所述蛋白質或表達載體。本專利技術還提供一種檢測c-Myc標簽的方法，含有本專利技術所述針對c-Myc標簽的單域重鏈抗體。基于本專利技術提供的針對c-Myc標簽的單域重鏈抗體與c-Myc標簽特異性結合的能力，建立c-Myc標簽的檢測方法。其中，優選的方法包括酶聯免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)，熒光免疫法(Fluoroimmunoassay,FIA)，免疫芯片法，親和層析法和免疫層析法等。本專利技術所提供的氨基酸序列可以作為前體，通過隨機或定點突變技術進行改造，能夠獲得性質(水溶性、穩定性、親和力以及特異性等)更好的突變體，該突變體能與c-Myc標簽特異性結合。本專利技術還涉及前述針對c-Myc標簽的單域重鏈抗體在免疫檢測、富集以及純化中的應用。這些免疫檢測指的是非疾病診斷治療目的的免疫檢測。本專利技術還涉及針對c-Myc標簽的免疫親和吸附材料，包括載體，搭載在載體上的配基，其特征在于該材料以針對c-Myc標簽的納米抗體作為配基，所述針對c-Myc標簽的納米抗體具有SEQIDNO.:1所示的氨基酸序列。載體材料不限于瓊脂糖凝膠，也可以選用硅球、納米磁珠等。本專利技術所敘述的一些術語具有如下含義：結構域：蛋白質三級結構的基本結構單位，通常具有一定的功能。IMGT編號：IMGT數據庫(TheInternationalImMunoGeneTicsDatbase)中的一種已經標準化的抗體氨基酸序列編號方法。具體編號方法可以參考文獻(Ehrenman,F.,Q.Kaas,et.al.(2010).IMGT/3Dstructure-DBandIMGT/DomainGapAlign：adatabaseandatoolforimmunoglobulinsorantibodies,Tcellreceptors,MHC,IgSFandMhcSF.NucleicAcidsRes38(Databaseissue):D301-307.Lefranc,M.P.,C.Pommie,etal.(2003).IMGTuniquenumberingforimmunoglobulinandTcellreceptorvariabledomainsandIgsuperfamilyV-likedomainsDevcompImmunol27(1):55-77.)中的描述。密碼子(codon)：又稱為三連體密碼子(tripletcode)，指對應于某種氨基酸的核苷酸三聯體。在轉譯過程中決定該種氨基酸插入生長中多肽鏈的位置。具體實施方式下面通過單域重鏈抗體(多肽)的制備、分析及應用，對本專利技術做進一步說明，這些具體實施例不應以任何方式被解釋為限制本專利技術的應用范圍。實施例1：抗c-Myc標簽單域重鏈抗體(即針對c-Myc標簽的單域重鏈抗體)免疫文庫的構建將c-Myc標簽與牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin，BSA)共價偶聯，得到c-Myc人工抗原c-Myc-BSA，取300μgc-Myc-BSA與弗氏完全佐劑乳化后，對羊駝(Lamapacos)進行皮下多點注射免疫。加強免疫采用150μgc-Myc-BSA與弗氏不完全佐劑乳化，間隔2周進行，每次免疫7天后靜脈取血，采用間接ELISA法測定血清效價，選擇血清效價最高的樣品分離淋巴細胞，提取RNA。RNA的提取參照TAKARA公司RNAiso試劑說明書進行。以RNA為模板，oligodT為引物，參照TAKARA公司反轉錄酶說明書合成cDNA第一鏈。采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，經巢式PCR獲得重鏈抗體的可變區編碼基因(采用的引物見表1)。第一輪PCR分別以引物AlpVh-LD和CH2-R擴增cDNA，反應條件為，98℃，10s，55℃，20s，72℃，1min，20個循環，98℃，10s，68℃，1min，72℃延伸10min。將第一輪PCR產物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳，回收600bp～750bp的DNA片段，作為第二輪PCR的模板，分別用引物AlpVh-SfiI和AlpVHHR1-NotI，AlpVh-SfiI和AlpVHHR2-NotI，進行擴增，反應條件為，98℃，10s，50℃，20s，72℃，40s，5個循環，98℃，10s，68℃，40s，30個循環，72℃延伸10min。經DNA片段回收試劑盒回收、定量，于-20℃保存備用。將噬菌粒pHEN1和PCR擴增產物分別用SfiI、NotI雙酶切，經瓊脂糖凝膠回收、定量后，以1∶3摩爾比，在16℃，過夜連接。表1文庫構建及鑒定所用的引物注：下劃線表示限制性內切酶識別序列連接產物經乙醇沉淀后，溶于10μL無菌水，分十次進行電穿孔轉化大腸桿菌T本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種針對c?Myc標簽的納米抗體，具有SEQ?ID?NO.:1所示的氨基酸序列。
【技術特征摘要】
1.一種針對c-Myc標簽的納米抗體，具有SEQIDNO.:1所示的氨基酸序列。2.一種核酸分子，其特征是編碼權利要求1中所述氨基酸序列。3.根據權利要求2所述的核酸分子，其特征在于序列如SEQIDNO.:2。4.一種包含權利要求2所述的核酸序列的載體。5.一種包含權利要求4所述的載體的宿主細胞。6.權利要求1所述的針對c-Myc標簽的納米抗體在免疫檢測、富集純化c-Myc標簽中的應用。7.權利要求1所述的針對...
【專利技術屬性】
技術研發人員：付金衡，吳蘭，涂追，許楊，吳青松，
申請(專利權)人：南昌大學，
類型：發明
國別省市：江西,36
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