谷子抗逆基因SiRLK35及編碼蛋白與應用制造技術

本發明專利技術公開了一種谷子抗逆基因SiRLK35及編碼蛋白與應用。本發明專利技術在谷子中分離獲得類受體蛋白激酶SiRLK35，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，該基因編碼蛋白產物屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。本發明專利技術對該基因在逆境條件下的表達模式進行了研究，同時對該基因進行原核表達載體的構建，驗證了該基因可在蛋白水平進行表達，利用斑點法和基因原核表達系統對該基因的功能進行了初步驗證，同時檢測了該基因在鹽處理條件下的生長曲線，通過將該基因異源轉化入水稻并獲得相應的轉基因植株，對其在抗鹽及抗逆過程中的作用進行了初步鑒定，對進一步實現對谷子進行有目的，有針對性的品質、性狀改良，創新谷子抗逆新種質，具有指導作用。

【技術實現步驟摘要】
谷子抗逆基因SiRLK35及編碼蛋白與應用
本專利技術屬于基因工程
，具體說，涉及谷子抗逆基因SiRLK35及編碼蛋白與應用。
技術介紹
干旱是影響植物正常生長發育的重要限制性因素之一，由于水資源在時間和空間上的分布不均，以及環境變化而引起的世界性的水資源短缺，影響了全球64％的耕地。就我國現狀，每年的農業生產缺水為300億立方米，因干旱造成的糧食損失約為400億斤/年，水資源短缺使得糧食安全問題受到嚴重威脅。植物受到干旱脅迫時，最直接的影響就是植物細胞脫水。細胞脫水后，細胞膜細胞壁發生分離，細胞膜原有的結構遭到破壞，膜脂分子結構呈無序放射狀排列，膜上出現空隙，膜透性增大，膜蛋白解離，胞質內的可溶性糖、電解質、氨基酸等外流；缺水使氣孔關閉，CO2擴散受阻，葉綠體結構改變，光系統II活性受到影響，酶活降低，光合磷酸化解偶聯，導致光合作用減弱；水分不足時，分生組織分裂減弱或停止，細胞伸長速度減慢，從而使植物生長受到受抑；植物細胞脫水抑制合成代謝，加強了分解代謝，使細胞正常代謝遭到破壞。導致植物生長停滯甚至死亡。植物在受到干旱脅迫時，細胞感知并將胞外信號傳遞到胞內，引起胞內第二信使(如Ca2+、活性氧(ROS)、NO、磷酸鹽等)的產生，第二信使通過進一步調控相關蛋白激酶的活性，調節下游蛋白的磷酸化狀態，最終通過磷酸化作用激活轉錄因子而調控相應的基因表達。自從1990年首次報道從玉米中克隆到第一個S型植物類受體蛋白激酶(SRLKs)基因Zmpk1之后，在其它物種中也均有發現。目前已知在擬南芥中大約存在40個SRLKs，水稻中有147個。其中甘藍中的SRK、SFR2；擬南芥中的ARK1、ARK2、ARK3、RLK1和PR5K，水稻中的OsPK10及煙草中的NTS16及BcRK，均屬于SRLKs。目前，對于SRLKs功能研究的報道并不多，這類蛋白主要在植物種胚形態發生、發育及自交不親和等方面具有重要的生物學功能。含有S-結構域的RLKs(SRLKs)作為RLKs家族中第二大類，廣泛存在于單子葉及雙子葉植物中。近年來，隨著對RLKs研究的深入，對SRLKs生物學功能的研究也越來越受到人們的關注。Kim等(2009)研究發現，CBRLK1(calmodulin-bindingreceptor-likeproteinkinase)編碼一個S-型的類受體蛋白激酶，能夠通過調控PR1基因的表達負調擬南芥的抗病反應。進一步研究發現，CBRLK1能與鈣調素互作，而鈣調素(Calmodulin,CaM)通過與胞內重要第二信使Ca2+直接作用，在植物細胞感知外界刺激進行原初響應及信號向下游的轉導過程中具有重要作用。水稻中OsSIK2編碼一個SRLK蛋白，其表達能明顯的被ABA、PEG、NaCl和4℃所誘導；過表達OsSIK2可增強轉基因水稻對干旱和鹽脅迫的抗性，而且過表達株系表現出葉片提前發育和延遲衰老的表型。最近在大豆中研究發現，GsSRK編碼一個SRLK，其表達能夠明顯的被ABA、干旱和鹽脅迫所誘導，在擬南芥中過表達GsSRK能明顯增強轉基因株系在鹽脅迫下種子的萌發、主根的伸長及蓮座葉的生長等。這些結果表明SRLKs可參與非生物脅迫響應，并可能通過對脅迫信號進行整合從而對植株的發育進行調控，使植株更好的適應不利的環境。谷子(SetariaitalicaL.Beauv.)又稱為粟，是我國傳統優勢作物及糧飼兼用作物，在我國北方地區種植廣泛，其種植面積占世界的80％。但由于基因組測序工作的滯后，長期以來谷子未受到國際科學界的關注。進入21世紀以來，谷子因其抗旱耐瘠、高光效、耐儲藏、基因組小以及生育期短等突出優勢迅速發展成為功能基因組研究新的候選模式作物。近年來其營養保健價值、國際競爭力和產量潛力被重新認識。因此，對谷子進行抗逆研究也越來越有必要，可以為對谷子進行有目的、有針對性的品質、性狀研究及抗旱機制的解析提供理論依據。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服現有技術的不足，提供了一種新的谷子抗逆基因SiRLK35。本專利技術以自然干旱處理的“豫谷1號”為材料，通過iTRAQ技術篩選到一表達量發生明顯變化的S型類受體蛋白激酶基因，命名為SiRLK35。通過構建SiRLK35基因的植物雙元表達載體，利用基因工程手段獲得了該基因的轉基因植物材料，對該基因的生物學功能及其在植物抗旱抗逆等方面的應用進行了研究。通過構建該基因的原核表達載體，檢測蛋白水平的表達情況，分析其在原核菌株中的功能，初步驗證了該基因的抗逆能力。通過對獲得的轉基因水稻植株進行干旱脅迫處理，初步驗證轉基因植株的抗逆能力，揭示該基因在植物抗逆過程中的作用。因此，本專利技術還有一個目的是在于提供了一種谷子抗逆基因SiRLK35在植物抗逆(抗旱和耐鹽)育種中的應用，提高了植物對逆境(干旱和水漬)的耐受能力，保證了作物的產量和品質免受或少受逆境脅迫的不利影響。為此，本專利技術采用的技術方案是：谷子抗逆基因SiRLK35，克隆該基因的方法是，首先提取谷子葉片的RNA，反轉錄得到單鏈cDNA，以單鏈cDNA為模板，以SEQIDNo.3和SEQIDNo.4序列所示的特異引物，通過PCR獲得SiRLK35基因的全長序列。引物序列如下：SiRLK35S11:5’-ACGGTTTATTTGCTTGGA-3’(SEQIDNo.3)SiRLK35A1:5’-TCATAAATTTGACTTCATTTCA-3’(SEQIDNo.4)所述谷子抗逆基因SiRLK35，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，該基因編碼產物屬于S型類受體蛋白激酶。本專利技術谷子抗逆基因SiRLK35的生物信息學分析顯示，該蛋白屬于S型類受體蛋白激酶(SRLKs)家族，基因序列分析顯示，SiRLK35包含1989個堿基，含有相對保守的蛋白激酶區，但進化分析顯示，其與擬南芥、水稻、玉米、大麥等植物中的SRLKs同源性較低，為7％-23％，與我們之前在水稻中分離到的種胚特異基因OsESG1的序列同源性也僅為9％。這種序列上的差異性，結合對其表達模式的初步分析，暗示SiRLK35在與SRLKs家族成員功能上具有一定的共性，但同時也具有特異的、獨特的功能，并可能在谷子抗旱的過程具有重要作用。為進一步研究SiRLK35基因的功能，本專利技術使用RT-PCR對該基因的表達模式進行研究，結果表明，SiRLK35可以被干旱、鹽脅迫、植物激素GA、ABA、MeJA等誘導表達，暗示該基因在植物抗逆和體內信號轉導方面發揮一定的作用。本專利技術還根據谷子SiRLK35基因序列設計特異引物，通過PCR方法擴增得到目的基因，酶切后，將目的基因SiRLK35與PET28a載體連接，獲得重組質粒pET28a-SiRLK35，以此質粒轉化大腸桿菌菌株BL21(DE3)，原核表達載體構建完成，IPTG誘導表達融合蛋白，SDS-PAGE電泳分析，獲得預期大小的蛋白條帶，證明該基因在蛋白水平完成了表達，并同時對其原核表達系統進行了優化。本專利技術同時利用斑點法對SiRLK35基因功能進行驗證，將成功轉入pET28a質粒和pET28a-SiRLK35重組質粒的大腸桿菌BL21(DE3)經IPTG誘導后，在含有不同濃度NaCl的LB平板培養基上點樣，3本文檔來自技高網...

【技術保護點】
谷子抗逆基因SiRLK35，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

【技術特征摘要】
1.谷子抗逆基因SiRLK35，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.一種權利要求1所述的谷子抗逆基因SiRLK35編碼的蛋白質，其序列為SEQIDNO.2所示。3.權利要求1所述的谷子抗逆基因SiRLK35在提高作物的抗旱方面的應用。4.權利要求1所述的谷子抗逆基因SiRLK35在提高作物的耐鹽方面的應用。5.克隆權利要求1所述的谷子抗逆基因SiRLK35的方法，其特征是，提取谷子RNA，反轉錄獲得單鏈cDNA，以單鏈cDNA為模板，用序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示特異引物，通過PCR獲得基因SiRLK35的全長序列。6.一種含有權利要求1所述的谷子抗逆基因S...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉煒，王一帆，潘教文，王慶國，李臻，
申請(專利權)人：山東省農業科學院生物技術研究中心，
類型：發明
國別省市：山東,37