新烏頭堿在制備鈣通道阻斷劑中的應用制造技術

本發明專利技術公開了新烏頭堿在制備鈣通道、特別是L?型鈣通道Cav1.2亞型阻斷劑中的應用。新烏頭堿濃度依賴性對鈣通道產生阻斷作用，可以將其作為鈣通道阻斷劑，用于治療高血壓等心血管疾病。不同于烏頭堿在臨床上引起的心律失常和消化道副作用，新烏頭堿的使用可以顯著避免上述副作用。

Application of new aconitine in preparation of calcium channel blocker

The invention discloses a new aconitine in preparation of calcium channel, especially L type calcium channel blocking agent in the application of Cav1.2 subtype. The concentration dependence of aconitine can block the calcium channel and can be used as a calcium channel blocker for the treatment of cardiovascular diseases, such as hypertension. Different from aconitine in the clinical arrhythmia and side effects of the digestive tract, the use of aconitine can significantly avoid the side effects.

【技術實現步驟摘要】
新烏頭堿在制備鈣通道阻斷劑中的應用
本專利技術屬于醫藥領域，具體涉及新烏頭堿在制備鈣通道、特別是L-型鈣通道Cav1.2亞型阻斷劑中的應用。
技術介紹
烏頭類中藥屬于毛茛科植物，在我國使用已有2000多年的歷史。其植物主根為烏頭，側根為附子，獨根為天雄，均可入藥，是臨床常用的祛風散寒、除痹止痛之品。附子為毛茛科植物烏頭子根的加工品，首次記載于《神農本草經》，被譽為“回陽救逆第一要藥”。烏頭堿(ACO)是主根烏頭的重要成分，其在臨床上已引起心律失常和消化道副作用。新烏頭堿(MACO)是側根附子的生物堿類物質，是ACO的結構類似物，共同擁有C19母核結構，文獻資料檢索結果分析表明，附子作為中醫的常用藥物，其藥理作用非常廣泛，具有抗炎鎮痛、強心、抗休克、抗心律失常等多種作用，臨床常用附子作為配伍藥用于治療厥逆亡陽、脈微欲絕；腎陽不足、畏寒肢冷；風寒濕痹、周身骨節疼痛等癥獲得了較好的效果。但烏頭堿以及新烏頭堿是否作用于L-型鈣通道以及作用效果如何目前并無任何報道。電壓門控型鈣通道按電生理特性可分為：高電壓門控型鈣通道及低電壓門控型鈣通道。前者分為：L-型、N-型、P/Q-型及R-型；后者又稱之為短暫T-型。L-型鈣通道是一種高電壓門控型鈣離子通道，普遍存在于體內各型細胞膜上。按其藥理學特性及表達不同，可分為Cav1.1、Cav1.2、Cav1.3及Cav1.4四種。Cav1.2型鈣通道分布廣泛，介導的鈣離子(Ca2+)內流誘導細胞產生鈣依賴的鈣釋放機制，使細胞發生相應的生理和生化反應。在心肌細胞膜上，Cav1.2亞型是L-型鈣通道的主要亞型，也是心肌細胞興奮過程中鈣離子內流的主要通道。Ca2+可通過L-型鈣通道的內流構成心室肌細胞動作電位平臺期。隨著Ca2+通過L-型鈣通道內流，激活了Ca2+從肌漿網中釋放，對鈣穩態和工作心肌細胞的興奮-收縮偶聯過程都起到重要作用。目前鈣通道、特別是L-型鈣通道阻斷劑，例如硝苯地平(Nifedipine)在臨床上廣泛用于高血壓、心絞痛以及心力衰竭等心血管疾病的預防或治療。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是克服現有技術中針對鈣通道的阻斷劑較少，且現有烏頭堿副作用大的現狀，提供一種新烏頭堿在制備鈣通道、特別是L-型鈣通道Cav1.2亞型阻斷劑中的應用。本專利技術解決上述技術問題的技術方案之一是：新烏頭堿在制備鈣通道阻斷劑中的應用。其中，所述新烏頭堿可以作為唯一活性成分；新烏頭堿還可以與其他活性成分例如其他現有鈣通道阻斷劑共同起作用。本專利技術所述鈣通道阻斷劑又稱鈣拮抗劑。L-型鈣通道，特別是Cav1.2亞型，其為心血管系統上的主要鈣通道之一，目前臨床上常用的鈣通道阻斷劑主要作用于L-型鈣通道。本專利技術中，較佳地，所述鈣通道為L-型鈣通道Cav1.2亞型。由此，本專利技術解決上述問題的技術方案之二是：新烏頭堿在制備預防和/或治療心血管疾病的藥物中的應用。所述心血管疾病為本領域現有L-型鈣通道能作用的心血管病，包括但不僅限于高血壓病、心絞痛等。新烏頭堿(MACO)的結構式如下：其中，新烏頭堿可以購買，也可以自行提取。在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本專利技術各較佳實例。本專利技術所用試劑和原料均市售可得。本專利技術的積極進步效果在于：新烏頭堿濃度依賴性對鈣通道，特別是L-型鈣通道Cav1.2亞型產生阻斷作用，可以將其作為鈣通道阻斷劑，用于治療高血壓等心血管疾病。不同于烏頭堿在臨床上引起的心律失常和消化道副作用，新烏頭堿的使用可以顯著避免上述副作用。附圖說明下面結合附圖及實施例對本專利技術作進一步描述：圖1：Cav1.2轉染HEK293細胞，電生理驗證其介導的L-型鈣通道電流。其中，HEK293細胞鉗制在-70mV，刺激方波采用-60mV至0mV，刺激時程為150ms。A，DMSO溶劑(0.1％)對HEK293細胞轉染的Cav1.2電流無任何作用(n＝5)。B，硝苯地平(Nifedipine)(5μM)可顯著阻斷L-型Cav1.2電流(n＝5)。C，統計柱狀圖顯示DMSO溶劑及硝苯地平對Cav1.2電流的作用。***p<0.001vs.對照組(control)，“對照”組在檢測時沒有添加試劑。圖2：新烏頭堿可劑量依賴性抑制Cav1.2通道電流。其中，A，不同濃度的新烏頭堿對Cav1.2電流的抑制示意圖。HEK293細胞鉗制在-70mV，刺激方波采用-60mV至0mV，刺激時程為150ms。B，新烏頭堿濃度依賴性抑制Cav1.2通道電流。濃度依賴曲線采用sigmoidalHill方程(Y＝1/(1+10(logIC50-X)nH)擬合。括號內數字為各濃度新烏頭堿的細胞記錄個數。“對照”組在檢測時沒有添加試劑。具體實施方式下面通過實施例的方式進一步說明本專利技術，但并不因此將本專利技術限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。實施例1HEK293細胞轉染及Cav1.2電流驗證1.實驗材料：HEK293細胞購自美國ATCC公司，轉染用試劑組分購自美國SIGMA公司。2.實驗方案：1)細胞培養及轉染：取一瓶培養良好的HEK293細胞(判斷標準：貼瓶壁70-80％，光鏡下細胞色澤較亮，無明顯的漂浮細胞)，棄培養液，加入HBSS(Hank's平衡鹽溶液)輕洗兩遍后加入約1mL的0.25％胰蛋白酶(trypsin)消化液消化，約3分鐘后加入DMEM高糖培養液(購自Hyclone公司)吹打，使細胞懸浮，將細胞懸液轉入一離心管中，離心，1000轉/分，約5分鐘，棄去上清液，加入DMEM高糖培養液，吹打使細胞懸浮。然后取1ml細胞懸液至已有DMEM高糖培養液的離心管中，緩慢吹打再取1ml細胞懸液至1ml的DMEM高糖培養基中，傳代至35mm的培養皿中。24小時后進行轉染。細胞轉染采用磷酸鈣轉染法。具體如下，恒溫培養箱中取出24小時前放入的HEK293細胞，換液DMEM培養基，放入培養箱中待用。將Cav1.2鈣離子通道亞單位(質粒)Cav1.21.5μg、α2δ1.25μg(含eGFP綠色熒光基因)，β2α1.25μg，TAG(Cav1.2，α2δ，β2α，TAG質粒取自新加坡國立大學SoongTuckWah實驗室)(Liaoetal.,JBC,2015)0.25μg混合后，往其中加入75μlCaCl2溶液，混合均勻后逐滴加入到75μl2×HBS溶液中，緩慢吹打，靜置12分鐘后逐滴加入到已貼壁細胞，移入恒溫培養箱，48小時后運用全細胞膜片鉗記錄。2)電流記錄：應用全細胞膜片鉗記錄帶有熒光的HEK293細胞Cav1.2電流，每組記錄3-7個細胞。檢測時，待電流穩定后(約2分鐘后)在培養液中分別加入DMSO溶劑(0.1％)、硝苯地平(5μM)。3.實驗結果：如圖1(A)-(C)所示，1‰DMSO作為陰性對照對L-型鈣電流無明顯作用，抑制率為0.32％(n＝5)；如圖1(B)-(C)所示，10μM硝苯地平作為陽性對照能夠顯著抑制L-型鈣電流，抑制率為86.6％(n＝5)。HEK293細胞鉗制在-70mV，刺激方波采用-60mV至0mV，刺激時程為150ms。A，DMSO溶劑(0.1％)對HEK293細胞轉染的Cav1.2電流無任何作用(n＝5本文檔來自技高網...

【技術保護點】
新烏頭堿在制備鈣通道阻斷劑中的應用。

【技術特征摘要】
1.新烏頭堿在制備鈣通道阻斷劑中的應用。2.如權利要求1所述的新烏頭堿在制備鈣通道阻斷劑中的應用，其特征在于，所述新烏頭堿為唯一活性成分。3.如權利要求1或2所述的新烏頭堿在制備鈣通道阻斷劑中的應用，其特征在于，所述鈣通道為L-型鈣通道。4.如權利要求3所述的新烏...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李華，陶金，李旻，季和夷，
申請(專利權)人：上海益諾思生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：上海,31