酶促合成煙酰胺尿嘧啶二核苷酸的方法技術

本發明專利技術涉及一種酶促合成煙酰胺尿嘧啶二核苷酸的方法及其應用。利用煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶突變體為催化劑，催化煙酰胺單核苷酸和尿嘧啶核苷三磷酸耦合反應，制備煙酰胺尿嘧啶二核苷酸。在微生物細胞內表達煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶突變體的編碼基因，工程菌利用內源代謝物合成煙酰胺尿嘧啶二核苷酸，并且胞內煙酰胺尿嘧啶二核苷酸可作為輔酶，選擇性介導氧化還原反應，提高目標代謝產物產量。在一個典型實例中，琥珀酸產量提高了35％。

Enzymatic synthesis of nicotinamide uracil dinucleotide

The present invention relates to a method for enzymatic synthesis of nicotinamide uracil dinucleotide and uses thereof. Nicotinamide uridine aminotransferase mutant was used as a catalyst to catalyze the coupling reaction between nicotinamide mononucleotide and uracil three, and nicotinamide uracil dinucleotide was prepared. The gene encoding nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase mutants expressed in microbial cells, engineered bacteria using endogenous metabolites of nicotinamide dinucleotide uracil, and intracellular nicotinamide dinucleotide uracil as coenzyme mediated selective redox reaction, improve the yield of the secondary metabolites. In a typical example, succinic acid production has increased by 35%.

【技術實現步驟摘要】
酶促合成煙酰胺尿嘧啶二核苷酸的方法
本專利技術屬于生物工程
，涉及酶促合成煙酰胺尿嘧啶二核苷酸(nicotinamideuracildinucleotide，NUD)的方法及其應用，在微生物細胞內表達煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶突變體的編碼基因，工程菌利用內源代謝物合成NUD，并且胞內NUD可作為輔酶，選擇性介導氧化還原反應，提高目標代謝產物產量。
技術介紹
煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及其還原態(NADH)在細胞的繁殖，生長，分化，凋亡等生命活動中都起著非常重要的作用(W.Ying，etal.AntioxidantsRedoxSignaling.2008，10，179)。除此之外，NAD還是許多重要氧化還原酶的輔酶，起傳遞氫和電子的作用。其結構式如下：由于生物體內NAD(H)同時參與多種反應，因此在大部分目標產物的生物代謝網絡中，都會存在一步或多步利用NAD(H)的反應。現階段通常采用輔因子工程對目標代謝網絡進行調控。常見的策略有，1)改變胞內輔酶合成，降解，回補代謝和不同輔酶分子相互轉化的能力，2)改變氧化還原酶的輔酶偏好性，3)在細胞內表達可再生輔酶的酶，如葡萄糖脫氫酶等，并在培養環境中額外添加相應酶的底物。但是，由于NAD(H)是一種通用的輔酶，胞內NAD(H)水平及不同氧化態的擾動往往會對細胞生理及代謝等產生難以預測的全局性影響。因此，為了實現特異性調控目標代謝網絡，亟需一種方法使目標代謝網絡從復雜代謝網絡中獨立出來，即需要重新設計出一個生物正交系統(K.Shokat，etal.DrugDiscoveryToday.2002，7，872)。在依賴于NAD類似物的生物正交系統中，NAD(H)類似物可以在該正交代謝途徑中傳遞，而不影響其他利用NAD(H)的代謝途徑，同樣，其他代謝途徑中的NAD(H)也不會影響到生物正交代謝途徑。因此，僅靠調控NAD(H)類似物的含量就可以對生物正交系統進行特異性的代謝調控，從而達到提高目標途徑產量的目的。由于依賴于NAD(H)的氧化還原酶與其輔酶的主要結合作用發生在腺嘌呤結合域，吡啶環部分主要起傳遞電子的作用，因此，為了保證NAD類似物的氧化還原性能，只能對NAD的腺嘌呤環部分進行改造。目前，大多數NAD類似物均采用化學法合成。但是，化學法合成NAD類似物通常面臨步驟繁瑣，化學性質不穩定，分離，純化較困難，且成本較高，不能直接應用于生物體等問題。因此，有人采用酶促方法合成NAD類似物(H.迪費爾，D.海因德爾，C.邁爾，R.施姆克，CARBA-NAD的酶促合成，申請號：201080033434.1)。其借助野生型煙酰胺核糖激酶(RNK)和煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶(NMNAT)進行NAD類似物的酶促反應合成。其中，煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶(nicotinamide/nicotinicacidmononucleotideadenylyltransferase，NMNAT)根據物種來源不同，分別可由基因nadD，nadM，nadR表達，將煙酰胺單核苷酸(nicotinamidemononucleotide，NMN)或煙酸單核苷酸(nicotinicacidmononucleotide，NaMN)和腺苷三磷酸(ATP)進行縮合反應合成NAD或NaAD，是NAD生物合成途徑中的關鍵酶。雖然在體外反應條件下，野生NMNAT也可表現出很低的合成少數NAD類似物的活性(M.Emanuelli，etal.ProteinExpressionandPurification.2003，27，357)，但不足以用于制備或進行胞內直接合成NAD類似物。煙酰胺尿嘧啶二核苷酸(nicotinamideuracildinucleotide，NUD)是一種NAD類似物，可作為輔酶介導氧化還原反應。通過構建依賴NUD的氧化還原酶，可以建立生物正交的氧化還原體系，用于控制細胞內代謝過程(D.Ji，etal.JournaloftheAmericanChemicalSociety.2011，133，20857)。雖然通過化學方法可以合成NUD，但NUD和NAD一樣，不能自由透過細胞膜，成為胞內應用NUD的瓶頸。因此，需要建立一種酶促合成NUD的方法，以利用細胞內源代謝物直接在胞內合成NUD。
技術實現思路
針對化學法合成NUD步驟繁瑣，分離純化困難，NUD難以進入細胞等缺點，并且目前尚未發現可高效催化合成NUD的酶，本專利技術的目的是提供一種酶促合成NUD的方法，以煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶的突變體為催化劑，以煙酰胺單核苷酸和尿嘧啶核苷三磷酸為底物，催化合成NUD，并且通過在胞內表達煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶的突變體，實現直接在胞內合成NUD，應用于選擇性調控代謝過程和提高目標代謝產物產量。一方面，本專利技術提供了一種酶促合成煙酰胺尿嘧啶二核苷酸(NUD)的方法，以煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶的突變體為催化劑，以煙酰胺單核苷酸(NMN)和尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)為底物，合成煙酰胺尿嘧啶二核苷酸。在一些實施方式中，煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶的氨基酸序列為SEQIDNO：1，SEQIDNO：2或SEQIDNO：3中的一種或二種以上，其中，SEQIDNO：1是來源于大腸桿菌的NadD的氨基酸序列，SEQIDNO：2是來源于大腸桿菌的NadR的氨基酸序列，SEQIDNO：3是來源于土拉熱弗朗西絲氏菌的NadM的氨基酸序列。煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶的突變體為上述氨基酸序列中的1個以上氨基酸進行突變獲得的突變體，突變位點為下述序列中氨基酸位點中的一種或二種以上：一種在SEQIDNO：1的氨基酸序列中的突變位點為：22位突變為S，L，A或G中的一種，23位突變為T，G或L中的一種，45位突變為W，Y或L中的一種，82位突變為K，E，L或T中的一種，84位突變為K，W，E，A，L，V，M，T或P中的一種，86位突變為R，F，D，K，S或W中的一種，107位突變為F，V，R，L，S，A，W或P中的一種，109位突變為G，A或S中的一種，118位突變為D，H，T，P，G，N，A或R中的一種，132位突變為I，A，V，P，F，G，L，R或Q中的一種，174位突變為I，A，R，P，L，G，V，K，D或M中的一種，175位突變為T，K，S，N，M，W，E或G中的一種，176位突變為M，G，S，A，P，T，R或K中的一種，177位突變為A，E，L，P，R或S中的一種，或178位突變為P，I，V，S，R，G，T或L中的一種，174，175，176位缺失突變為兩個氨基酸d，e，其中d為A，S，T或P中的一種，e為S，P，G或A中的一種，或174，175位插入突變為三個氨基酸d，e，f，其中d為K，L，P，T，V或D中的一種，e為G，P，M，L，V，T，R，D或I中的一種，f為P，R，T，E，Q，K，V或S中的一種，產生的一種或兩種以上突變的新蛋白質；或，一種在SEQIDNO：2的氨基酸序列中的突變位點為：82位突變為S，L，A或G中的一種，83位突變為R，I或K中的一種，88位突變為F，V，M或L中的一種，148位突變為N，Q，H或S中的一種，154位突變為H，Y或F中的一種，176位突變為G，A或S中的一種，205位突變為P本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種酶促合成煙酰胺尿嘧啶二核苷酸的方法，其特征在于：以煙酰胺單核苷酸和尿嘧啶核苷三磷酸為底物，以煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶的突變體為催化劑，合成煙酰胺尿嘧啶二核苷酸；所述煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶的氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1，SEQ?ID?NO：2或SEQ?ID?NO：3中的一種或二種以上，所述煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶的突變體為上述氨基酸序列中的1個以上氨基酸進行突變獲得的突變體，突變位點為下述序列中氨基酸位點中的一種或二種以上：一種在SEQ?ID?NO：1的氨基酸序列中的突變位點為：22位突變為S，L，A或G中的一種，23位突變為T，G或L中的一種，45位突變為W，Y或L中的一種，82位突變為K，E，L或T中的一種，84位突變為K，W，E，A，L，V，M，T或P中的一種，86位突變為R，F，D，K，S或W中的一種，107位突變為F，V，R，L，S，A，W或P中的一種，109位突變為G，A或S中的一種，118位突變為D，H，T，P，G，N，A或R中的一種，132位突變為I，A，V，P，F，G，L，R或Q中的一種，174位突變為I，A，R，P，L，G，V，K，D或M中的一種，175位突變為T，K，S，N，M，W，E或G中的一種，176位突變為M，G，S，A，P，T，R或K中的一種，177位突變為A，E，L，P，R或S中的一種，或178位突變為P，I，V，S，R，G，T或L中的一種，174，175，176位缺失突變為兩個氨基酸d，e，其中d為A，S，T或P中的一種，e為S，P，G或A中的一種，或174，175位插入突變為三個氨基酸d，e，f，其中d為K，L，P，T，V或D中的一種，e為G，P，M，L，V，T，R，D或I中的一種，f為P，R，T，E，Q，K，V或S中的一種，產生的一種或兩種以上突變的新蛋白質；或，一種在SEQ?ID?NO：2的氨基酸序列中的突變位點為：82位突變為S，L，A或G中的一種，83位突變為R，I或K中的一種，88位突變為F，V，M或L中的一種，148位突變為N，Q，H或S中的一種，154位突變為H，Y或F中的一種，176位突變為G，A或S中的一種，205位突變為P，Q，V，R，G，K，N或L中的一種，176，177位插入突變為三個氨基酸a，b，c，其中a為P，G或I中的一種，b為V，S或A中的一種，c為S，C，I，H或W中的一種，或203，204，205位缺失突變為兩個氨基酸d，e，其中d為E，L，M，F，L或V中的一種，e為A，E，D，N，G，V或I中的一種，產生的一種或兩種以上突變的新蛋白質；或，一種在SEQ?ID?NO：3的氨基酸序列中的突變位點為：21位突變為M，S，K，T，L，F，G，W，Q或R中的一種，23位突變為R，T，L或Q中的一種，24位突變為N，W，K，S，F，R，G，V，T，D，P，E或A中的一種，110位突變為S，R，L，N或Q中的一種，130位突變為P，G，A或S中的一種，131位突變為A，G，R，F，S，L，E，V，C，W，I或P中的一種，132位突變為R，W，V，A，S或G中的一種，133位突變為V，T，Q，L或E中的一種，134位突變為P，E，A或G中的一種，135位突變為T，G，S，K或R中的一種，136位突變為I，L或V中的一種，或137位突變為S，H或D中的一種，產生的一種或兩種以上突變的新蛋白質。...

【技術特征摘要】
1.一種酶促合成煙酰胺尿嘧啶二核苷酸的方法，其特征在于：以煙酰胺單核苷酸和尿嘧啶核苷三磷酸為底物，以煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶的突變體為催化劑，合成煙酰胺尿嘧啶二核苷酸；所述煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶的氨基酸序列為SEQIDNO：1，SEQIDNO：2或SEQIDNO：3中的一種或二種以上，所述煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶的突變體為上述氨基酸序列中的1個以上氨基酸進行突變獲得的突變體，突變位點為下述序列中氨基酸位點中的一種或二種以上：一種在SEQIDNO：1的氨基酸序列中的突變位點為：22位突變為S，L，A或G中的一種，23位突變為T，G或L中的一種，45位突變為W，Y或L中的一種，82位突變為K，E，L或T中的一種，84位突變為K，W，E，A，L，V，M，T或P中的一種，86位突變為R，F，D，K，S或W中的一種，107位突變為F，V，R，L，S，A，W或P中的一種，109位突變為G，A或S中的一種，118位突變為D，H，T，P，G，N，A或R中的一種，132位突變為I，A，V，P，F，G，L，R或Q中的一種，174位突變為I，A，R，P，L，G，V，K，D或M中的一種，175位突變為T，K，S，N，M，W，E或G中的一種，176位突變為M，G，S，A，P，T，R或K中的一種，177位突變為A，E，L，P，R或S中的一種，或178位突變為P，I，V，S，R，G，T或L中的一種，174，175，176位缺失突變為兩個氨基酸d，e，其中d為A，S，T或P中的一種，e為S，P，G或A中的一種，或174，175位插入突變為三個氨基酸d，e，f，其中d為K，L，P，T，V或D中的一種，e為G，P，M，L，V，T，R，D或I中的一種，f為P，R，T，E，Q，K，V或S中的一種，產生的一種或兩種以上突變的新蛋白質；或，一種在SEQIDNO：2的氨基酸序列中的突變位點為：82位突變為S，L，A或G中的一種，83位突變為R，I或K中的一種，88位突變為F，V，M或L中的一種，148位突變為N，Q，H或S中的一種，154位突變為H，Y或F中的一種，176位突變為G，A或S中的一種，205位突變為P，Q，V，R，G，K，N或L中的一種，176，177位插入突變為三個氨基酸a，b，c，其中a為P，G或I中的一種，b為V，S或A中的一種，c為S，C，I，H或W中的一種，或203，204，205位缺失突變為兩個氨基酸d，e，其中d為E，L，M，F，L或V中的一種，e為A，E，D，N，G，V或I中的一種，產生的一種或兩種以上突變的新蛋白質；或，一種在...

【專利技術屬性】
技術研發人員：趙宗保，王雪穎，劉玉雪，
申請(專利權)人：中國科學院大連化學物理研究所，
類型：發明
國別省市：遼寧,21