一種DNA分子與重組病毒及它們的制備方法和用途技術

本發明專利技術涉及生物技術領域，公開了一種DNA分子與重組病毒及它們的制備方法和用途。所述DNA分子含有串聯連接的5’非編碼區序列、衣殼蛋白的編碼序列、5’端連接有終止密碼子序列的內部核糖體進入位點序列對應的DNA序列、膜蛋白前體的編碼序列、包膜蛋白的編碼序列、非結構蛋白的編碼序列和3’非編碼區序列，其中，除5’端連接有終止密碼子序列的內部核糖體進入位點序列對應的DNA序列外的序列均來源于黃熱病毒減毒株。所述重組病毒的基因組RNA對應的cDNA序列與所述DNA分子的序列相同。本發明專利技術的DNA分子可用于構建重組病毒，從而獲得能夠有效預防黃熱病毒感染的疫苗。

DNA molecule and recombinant virus and preparation method and application thereof

The invention relates to the technical field of biology, and discloses a DNA molecule and a recombinant virus and a preparation method and an application thereof. The DNA molecule contains series connected 5 'non encoding region sequence, capsid protein encoding sequence, 5' end is connected with a stop codon sequence of the internal ribosome entry site sequence corresponding to the sequence of DNA, membrane protein precursor sequence, encoding envelope protein encoding sequence, non structural protein encoding sequences and 3 \non encoding region sequence, the sequence in the 5 'end is connected with the DNA sequence of stop codon sequences of internal ribosome entry site sequence corresponding to the outside are derived from the yellow fever virus attenuated strain. The genomic RNA of the recombinant virus corresponds to a sequence of cDNA identical to the sequence of the DNA molecule. The DNA molecule of the invention can be used to construct the recombinant virus, which can effectively prevent the yellow fever virus vaccine.

【技術實現步驟摘要】
一種DNA分子與重組病毒及它們的制備方法和用途
本專利技術屬于生物
，涉及一種DNA分子與重組病毒及它們的制備方法和用途，具體地，涉及一種DNA分子及其制備方法與應用、重組病毒及其制備方法與應用以及含有所述重組病毒的疫苗。
技術介紹
黃熱病(YellowFever，YF)，是一種由黃熱病毒(Yellowfevervirus，YFV)引起的、對人類和非人類靈長類具有高度致死性的出血性疾病。黃熱病毒屬黃病毒科，黃病毒屬。其基因組為單股正鏈RNA，長度約為11kb，5’端包含1型帽子結構，中間為單一開放閱讀框，3’端為不含PolyA的UTR區域。通過經典帽子結構起始的翻譯途徑，YF17D單一ORF編碼一多聚蛋白，包含三個結構蛋白(衣殼蛋白C、膜和膜蛋白前體prM、包膜蛋白E)和七個非結構蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。黃熱病由蚊蟲傳播，主要流行于非洲和南美洲，每年大約有20萬感染病例的報道，其中90％發生在非洲。人感染黃熱病毒以后會產生一系列癥狀包括：發熱，惡心，嘔吐等，進一步發展為多器官衰竭，出血最終出現死亡。目前，針對黃熱病仍然缺乏特效的治療手段，疫苗接種是最有效的預防病毒感染的措施。黃熱減毒活疫苗YF17D是公認的為最安全有效的減毒活疫苗之一，被廣泛使用，到目前為止已經超過5億人次接種使用。YF17D具有較高的免疫效價，單次接種能夠在90％到99％接種者體內誘導中和性抗體的產生，提供98％的保護效果，并且持續至少10年時間。雖然黃熱減毒活疫苗YF17D安全有效，但是越來越多的報道指出，接種該疫苗以后會引起一系列副作用，包括發熱，頭痛，接種區域紅疹等。更為嚴重的還會較低幾率地引起內臟嗜性疾病和神經系統副作用疾病，對接種者的生命安全造成威脅。因此，研發一種新的更加安全的黃熱減毒活疫苗具有重要的公共衛生意義和經濟價值。
技術實現思路
本專利技術的目的是克服現有技術的不足，提供一種能夠用于制備預防黃熱病毒感染的疫苗的DNA分子與重組病毒及它們的制備方法和用途。為了實現上述目的，第一方面，本專利技術提供了一種DNA分子，該DNA分子含有串聯連接的5’非編碼區序列、衣殼蛋白的編碼序列、5’端連接有終止密碼子序列的內部核糖體進入位點序列對應的DNA序列、膜蛋白前體的編碼序列、包膜蛋白的編碼序列、非結構蛋白的編碼序列和3’非編碼區序列，其中，5’非編碼區序列、衣殼蛋白的編碼序列、膜蛋白前體的編碼序列、包膜蛋白的編碼序列、非結構蛋白的編碼序列和3’非編碼區序列來源于黃熱病毒減毒株。內部核糖體進入位點(InternalRibosomEntrySite，IRES)是一段特異RNA序列，能夠結合核糖體，誘導蛋白翻譯。在本專利技術的一種優選實施方式中，本專利技術的專利技術人通過反向遺傳學技術將IRES整合入黃熱病毒減毒株基因組內部，獲得了一株高度減毒，并具有較好免疫效果的黃熱疫苗株。第二方面，本專利技術提供了一種制備第一方面所述的DNA分子的方法，該方法包括在黃熱病毒減毒株基因組RNA對應的cDNA中第421-422位核苷酸之間插入5’端連接有終止密碼子的內部核糖體進入位點序列對應的DNA序列。第三方面，本專利技術提供了含有第一方面所述的DNA分子的表達盒、重組載體、轉基因細胞系、重組菌或重組病毒。第四方面，本專利技術提供了一種重組病毒，該重組病毒的基因組RNA對應的cDNA序列與第一方面所述的DNA分子的序列相同。第五方面，本專利技術提供了一種制備上述重組病毒的方法，該方法包括在黃熱病毒減毒株基因組的第421-422位核苷酸之間插入5’端連接有終止密碼子序列的內部核糖體進入位點序列。第六方面，本專利技術提供了一種疫苗，該疫苗的活性成分為上述重組病毒。第七方面，本專利技術提供了上述DNA分子和/或重組病毒在制備用于預防黃熱病毒感染的疫苗中的應用。第八方面，本專利技術提供了一種預防黃熱病毒感染的方法，該方法包括為受試者接種上述疫苗。本專利技術的DNA分子可用于構建重組病毒，從而獲得能夠有效預防黃熱病毒感染的疫苗。本專利技術提供的重組病毒具有如下多方面的優點：(1)充分減毒，安全性很高；(2)減毒特征穩定，遺傳穩定性好，回復為野生型病毒的可能性極低；(3)只在細胞質中復制(即RNA病毒基因組的復制、病毒的組裝、成熟釋放等過程均在細胞質中進行)，其攜帶的病毒基因組無整合到宿主細胞基因組中的危險；(4)能誘導產生針對黃熱病毒的免疫應答。綜上所述，本專利技術的重組病毒對預防黃熱病毒感染具有良好的應用前景。本專利技術的其它特征和優點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。附圖說明附圖是用來提供對本專利技術的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具體實施方式一起用于解釋本專利技術，但并不構成對本專利技術的限制。在附圖中：圖1為黃熱減毒疫苗株YF17D和重組病毒的全長RNA對應的cDNA的結構示意圖；圖2為實施例1的步驟三中瓊脂糖凝膠電泳的結果圖，其中，Maker：DL2000；圖3為實施例2所述的間接免疫熒光的結果；圖4為實施例3所述的空斑試驗的結果；圖5為實施例4所述的重組黃熱病毒在不同細胞內的增殖特征的測試結果；圖6為實施例5所述的各代重組黃熱病毒液空斑試驗的測試結果；圖7為實施例6所述的重組黃熱病毒的神經毒力特征的測試結果；圖8為實施例9所述的重組黃熱病毒的免疫原性的測試結果。具體實施方式以下對本專利技術的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本專利技術，并不用于限制本專利技術。第一方面，本專利技術提供的DNA分子含有串聯連接的5’非編碼區序列、衣殼蛋白的編碼序列、5’端連接有終止密碼子序列的內部核糖體進入位點序列對應的DNA序列、膜蛋白前體的編碼序列、包膜蛋白的編碼序列、非結構蛋白的編碼序列和3’非編碼區序列，其中，5’非編碼區序列、衣殼蛋白的編碼序列、膜蛋白前體的編碼序列、包膜蛋白的編碼序列、非結構蛋白的編碼序列和3’非編碼區序列來源于黃熱病毒減毒株。其中，本專利技術中使用的“來源于”意指根據病毒的基因序列(RNA)構建某蛋白的編碼序列(DNA)，并不限于從病毒基因組中提取獲得基因序列，例如，來源于黃熱病毒的序列是指與黃熱病毒的基因序列具有90％以上(優選100％)的同一性的序列；“串聯連接”是指將多核苷酸(或多肽)元件以有功能的方式連接，互不干涉表達或性能，被連接的多核苷酸(或多肽)序列是連續的。本專利技術中，對所述終止密碼子序列沒有特別的要求，可以為TAG、TAA或TGA。優選情況下，所述終止密碼子序列為TAA。本專利技術中，所述內部核糖體進入位點序列可以為各種病毒的內部核糖體進入位點序列，優選來源于腦心肌炎病毒。所述腦心肌炎病毒可以為野生型毒株。根據本專利技術的優選實施方式，所述內部核糖體進入位點序列對應的DNA序列如SEQIDNO:2所示。內部核糖體進入位點序列(IRES)是一段特異的RNA序列，能夠結合核糖體，誘導蛋白翻譯。本專利技術的專利技術人發現，通過使用該特異的序列能夠有效地減弱黃熱病毒減毒株的毒力。本專利技術中，所述黃熱病毒減毒株為黃熱減毒疫苗株YF17D。本專利技術中，所述5’非編碼區序列、衣殼蛋白的編碼序列、膜蛋白前體的編碼序列、包膜蛋白的編碼序列、非結構蛋白的編碼序列和3’非編碼區序列可以分別來源于同一基因型的黃熱本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種DNA分子，其特征在于，該DNA分子含有串聯連接的5’非編碼區序列、衣殼蛋白的編碼序列、5’端連接有終止密碼子序列的內部核糖體進入位點序列對應的DNA序列、膜蛋白前體的編碼序列、包膜蛋白的編碼序列、非結構蛋白的編碼序列和3’非編碼區序列，其中，5’非編碼區序列、衣殼蛋白的編碼序列、膜蛋白前體的編碼序列、包膜蛋白的編碼序列、非結構蛋白的編碼序列和3’非編碼區序列來源于黃熱病毒減毒株。

【技術特征摘要】
1.一種DNA分子，其特征在于，該DNA分子含有串聯連接的5’非編碼區序列、衣殼蛋白的編碼序列、5’端連接有終止密碼子序列的內部核糖體進入位點序列對應的DNA序列、膜蛋白前體的編碼序列、包膜蛋白的編碼序列、非結構蛋白的編碼序列和3’非編碼區序列，其中，5’非編碼區序列、衣殼蛋白的編碼序列、膜蛋白前體的編碼序列、包膜蛋白的編碼序列、非結構蛋白的編碼序列和3’非編碼區序列來源于黃熱病毒減毒株。2.根據權利要求1所述的DNA分子，其中，所述內部核糖體進入位點序列對應的DNA序列來源于野生型腦心肌炎病毒，優選地，所述內部核糖體進入位點序列對應的DNA序列如SEQIDNO：2所示。3.根據權利要求1或2所述的DNA分子，其中，所述黃熱病毒減毒株為黃熱減毒疫苗株YF17D。4.根據權利要求1-3中任意一項所述的DNA分子，其中，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。5.一種制備權利...

【專利技術屬性】
技術研發人員：秦成峰，李曉峰，王洪江，
申請(專利權)人：中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所，
類型：發明
國別省市：北京,11